一种检测与大脑中特性脑核及个别神经元机能活性相关表达及投影的方法.docVIP

一种检测与大脑中特性脑核及个别神经元机能活性相关表达及投影的方法 [摘 要]我们已经研究了一种观察大脑中机能活性神经元及投影的系统。这一个系统利用一些带有fos-tau-lacZ(FTL)基因的转基因老鼠，它能在受到不同刺激下的神经元和神经突中表达前者的基因lacZ。这个系统能够描绘从整个脑的表面到个别的神经元和其末梢的活动，这个系统通过组织化学检测神经元活动，通过免疫组织化学检测lacZ基因的产物β-半乳糖苷酶。此外，这只带有FTL的老鼠的下丘脑状态决定β-半乳糖苷酶的基本表达水平。我们详细地描述了如何检测FTL基因在老鼠中如何的表达，并讨论了在使用这种老鼠作为检测、描绘与功能活性相关的神经元的主要因素。 [关键字]FTL；β-半乳糖苷酶；表达 引言 神经生物学的主要任务是判断神经组成中的哪部分负责指令脑的动作。神经元之间的连接已经被下面的技术所辨别：点生理学记录，组织化学技术，捕捉追踪和功能图象。虽然这些方法有特殊和有利的方面，但它们在描绘功能活动路线时也存在不足。比如电生理学和功能图象并不是连贯性的呈现，还有追踪也没有标定哪些功能活动的神经元。一种判断脑哪一部分涉及功能活跃的方法是找到神经冲动的发出者。一些发出者是一些早期基因，它们诱导翻译因子的产生，使他们被迅速转录成神经元兴奋信号蛋白。在这些基因中，c-fos是研究最多的，它能被多种不同的刺激而表达。比如去偏极、钙汇集和许多不同的神经传递素所刺激[1-4]。然而，c-fos在细胞核中被完整地表达，但这种集中并没有提供那些连接信号或神经系统中冲动神经元的形态的信息。我们培养了一些带有转基因的老鼠，在它们的一根轴突上标有β-半乳糖苷酶的回应系统[5]，这个系统是在c-fos基因的控制下，在这些带有fos-tau-lacZ(FTL)的转基因老鼠中，神经元表达c-fos基因时会在一种溶解蛋白中经tau基因指定β-半乳糖苷酶的表达到轴突和树突中。.这可以用一个酶反应实验[6]或免疫组织化学分析来使神经细胞及其冲动传递呈现出来。因此，这些带有FTL基因的老鼠，它们在中央神经系统中在描绘活动功能区域和周边区域拥有很强的优势，以致于它们容许对细胞本身和芽枝的识别，最终来描绘功能活动区域。 下面我们将述几种不同的方法，利用带有FTL老鼠做实验，来显现出冲动的神经元及它们的末梢，还有能被刺激活跃的脑核和脑表层。 1 材料及方法 1.1 实验动物 雄性或雌性，大小在2-3个月间，转载有FTL基因的老鼠。这些老鼠被养在一个每12小时照明一次的房子里。所有的实验步骤是连续，也得到了墨尔本大学动物保护和利用委员会的容许。食物和水有allibitum供应，在以前较经典的方法下分析β-半乳糖苷酶的表达。老鼠在被取出培养箱后立即注射100μl致晕量的Lethabarb。在老鼠被麻醉后，将他们立即注射12毫升冷冻5％蔗糖溶液随后注射25毫升冰4％多聚甲醛的0.1磷酸盐缓冲液(pH 7.4 PFA)经过15分钟脑袋被拆除后于4℃浸泡在4％新鲜的PFA 15分钟转入20％蔗糖磷酸缓冲液(PBS)在4℃浸泡48小时然后脑部被冻结在Tissue-Tek中部分浸泡过水后再脱水一次切片相比一个鼠脑图从微观分析阳性(7) ℃孵化一夜然后用PBS冲洗部分孵化在用PBS稀释500倍的Alexa Tluor 488 山羊抗体Ig G中1小时区段用PBS冲洗如果是自由悬浮的它们将被固定在明胶上 此外在被PBS冲洗之后区段用10% CAS-Block 0.1%Trition X-100 的PBS稀释400倍的山羊抗体IgG中孵化1小时A和B)。但在大脑的许多部分，β-半乳糖苷酶的组织化学作用可以用来分析个体神经元之间的连接构造(图1B)。但是，在大密度的趋性的神经元区域中，比如皮层，这种染色区域就算利用β-半乳糖苷酶的组织化学检测，也是不能解决所有的神经元及轴突，在这些区域，有许多染色的轴突，组织化学反应中那些蓝色的沉淀也不能精确的解释那些发生在特有的轴突中的冲动过程。这些区域中，这些染色结构会以带有蓝色的蓝色细胞体出现。这些带有蓝色的染色结构在脑中的大部分区域都能看到。在这些区域里β-半乳糖苷酶有活性，比如前面接触面和本体的愈伤组织。 这些蓝色染色结构在带有FTL转基因的老鼠中，很容易被检测到，也很简单用来判断脑中哪些部分的β-半乳糖苷酶有活性。因为这个FTL基因的产物在表达后能在体细胞和神经细胞中发现，这是相比较fos的免疫组织化学这些带有FTL基因老鼠的一个优势，因为那里只有细胞核能被标记。在带有FTL基因的老鼠中β-半乳糖苷酶在完整的细胞中都能得到表达。β-半乳糖苷酶表达