DB21T 1861.2-2010 水产生物种质检验技术规程 扩增片段长度多态性法.docVIP

ICS67.120.30 B50 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/ T1861.2?—2010 水产生物种质检验技术规程 扩增片段长度多态性法 AFLP procedure to detect germplasm for aquaculture species 2010 - 12 - 31发布 2011 - 02 - 01实施 辽宁省质量技术监督局发布 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。 本标准归口单位：辽宁省海洋与渔业厅。 本标准主要起草人：刘卫东、高祥刚、赫崇波、李云峰、李宏俊、鲍相渤。 附录A、B、C均为资料性附录。  扩增片段长度多态性法????? 扩增片段长度多态性法 范围 本标准规定了水产生物扩增片段长度多态性分析（AFLP）的原理、试剂、仪器和设备、采样、分析步骤和数据运算方法。 本标准适用于水产生物种质检测与鉴定等方面的种质检验工作。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18654.15-2008 养殖鱼类种质检验 第15部分：RAPD分析 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 聚合酶链式反应PCR） 用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热 DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。.2 基因型enotype） 控制某一性状的基因组合。 3.3 座位ocus） 基因在染色体上所处的特定位置.4 等位基因llele） 基因的一种变异体在二倍体细胞内每个基因有两个等位基因，每个等位基因分别来自于各自的亲本。在一个群体中一个基因可能有许多等位基因。.5 多态性位点百分率 (Percent of Polymaorphic LociP) 表示后代所获得某个等位标记来自于它的父亲（或母亲）的同一个等位标记的可能性。.6 Nei’s 基因多样性指数（Gene Diversity，H）随机选择基因间的非同一的概率3.7 遗传距离enetic Distance，D） 用基因频率的函数表示的群体间遗传差异，它的最适宜的测度是单位长度DNA的核苷酸数或密码子的差数，是用来表示群体或个体之间遗传关系远近的一个量化指标，其值可以从0至无限大。群体或个体间的遗传距离越小，它们之间的亲缘关系越近，反之群体或个体间的遗传距离越大，那么它们之间的亲缘关系将越远。Shannon多样性指数(Shannon index，I)用来估算群落多样性的高低。clusters）的统计分析技术。 原理 扩增片段长度多态性法（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）的原理是对基因组总DNA酶切后经PCR进行选择性扩增，先将基因组DNA用两种限制性内切酶酶切成大小不等的片段，并与含有粘性末端的人工接头相连，形成酶切位点不同的限制性酶切片段，然后用与接头和位点相匹配的引物进行预扩增，预扩增产物作为进一步PCR扩增的模板，再选用特异引物进行选择性扩增，扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。由于不同来源DNA的酶切片段存在差异，因而产生了扩增产物的多态。 试剂 5.1 三羟甲基氨基甲烷Tris）饱和酚5.2 三氯甲烷：分析纯5.3 异戊醇：分析纯5.4 无水乙醇：分析纯5.5 20×TBE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷121g，硼酸61.7g，EDTA 7.44g，加超纯水到1L。 5.6 冰乙酸：分析纯5.7 琼脂糖： 5.8 核糖核酸（RNA）酶 5.9 蛋白酶K（20 mg/mL）： 5.10 丙烯酰胺：分析纯5.11 甲叉双丙烯酰胺：分析纯5.12 过硫酸铵：分析纯5.13 硝酸银（AgNO3）：分析纯5.14 四甲基乙二胺（TEMED）：分析纯5.15 无水碳酸钠：分析纯5.16 Taq DNA聚合酶（5 U/(L）5.17 标准分子量Markers（100bp）。 5.18 硝酸：分析纯5.19 37%甲醛5.20 乙二胺四乙酸：分析纯20%变性凝胶储存液：丙稀酰胺38.6g，双丙稀酰胺1.34g，尿素86g，20×TBE缓冲液10mL，加热溶解，超纯水定容到200mL后，用0.25μm的微孔滤膜抽滤，放置棕色瓶中4℃保存。 5.23 上样缓冲液：98％甲酰胺，10mM EDTA(pH8.0)，0.01％溴酚蓝及二甲苯青。 5.24 0.1mol/L硫代硫酸钠：将2.48g Na2S2O3?5H2O）溶于100 ml