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* Chapter7 Protein的分离、纯化和表征 一、Protein的酸碱性质 （一）Protein的两性解离★ 1、主链上两个末端α—NH2和α—COOH的解离 2、侧链上基团的解离 （二）Protein的等电点（PI） 1、定义：使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电荷为零时的溶液的pH值称为PI(isoelectric point). 2、当pH值 PI 时，蛋白质带负电荷 当pH值PI 时，蛋白质带正电荷 当pH值=PI 时，蛋白质带净电荷为零 3、等电点沉淀法用于分离纯化蛋白质 电泳分离 正极移动 负极移动 不移动 电泳 二、Protein的高分子性质 1、稳定性因素（299页）：（1）胶体性质（丁达尔现象、布郎运动）； （2）形 成水化膜；（3）双电离层 2、通透性：不易透过半透膜，可用透析的方法将蛋白质分子与其它 小分子物质分离，纯化蛋白质。 3、沉降系数（S）：蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心沉降，单 位力场中的沉降速度即该蛋白质的沉降系数，它表示沉 降分子的大小特性 。 三、Protein的变性与复性 1、定义：蛋白质在一定的理化因素的影响下，三维构象破坏，理化性质发生改变和生物学活性丧失，叫变性作用（denaturation)。其本质是高级结构破坏、一级结构不变。 蛋白质的复性：消除理化因素的影响，生物活性恢复或部分恢复。 加热凝固变性不可逆。 2、意义：生产和保存蛋白制品；消毒；提纯等应用。 四、Protein的沉淀（precipitation) 沉淀蛋白质的方法有 （一）盐溶盐析：中式盐，如硫酸铵，（降低蛋白质与水的亲和力 ）； （二）有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（破坏蛋白质胶粒上的水化层 ）； （三）重金属盐沉淀法：产生重金属蛋白盐沉淀； （四）生物碱试剂和某些酸类沉淀法：鞣酸、苦味酸、硝酸等 （五）加热变性沉淀法 五、Protein的颜色反应 （一）茚三酮反应：在pH5~7的溶液中，与茚三酮共热可产生蓝紫色物质，用于蛋白质的定性和定量。 （二）双缩脲反应：与双缩脲试剂（即碱性铜溶液）反应生成紫红色络合物，只与两个以上肽键化合物的特征反应。可用于蛋白质定性、定量或蛋白质水解程度的测定。 （三）酚试剂反应：与酚试剂（磷钼酸—磷钨酸化合物）作用生成蓝色物质，再用比色法定性和定量，其灵敏度比双缩脲反应高100倍。 六、Protein吸收光谱的特点 Phe、Tyr、Trp 具有吸收紫外光的能力，最大的吸收峰为280nm处，此外，蛋白质分子中的肽键可引起200~220nm的最大光吸收，可用于蛋白质的定性和定量。 七、Protein分子的免疫学特性 免疫球蛋白的结构和功能◆ 八、 Protein的分离纯化及鉴定 （一）Protein的提取（300页） 1、选材： 2、破碎：常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等机械破碎法。 3、提取： （二）Protein的分离纯化 1、盐析法：中性盐分级沉淀法，常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。 2、等电点沉淀法：净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。 3、有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 4、凝胶过滤（303页）（凝胶层析）(gel filtration chromatography):又叫分子筛层析，常用的凝胶有交联葡聚糖(sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel P)和琼脂糖凝胶(Bio-gel A)等。常用于大分子物质的分离纯化，以及蛋白质样品的脱盐和蛋白质分子量的测定等。 5、离子交换层析： 6、密度梯度（区带）离心：常用蔗糖密度梯度。 此外，有透析法、超过滤法、萃取法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳、超速离心、亲和层析等。 The End 蛋白质与氨基酸、多肽一样，能够发生两性解离（两性电解质），也有等电点（PI）。 阳离子交换剂本身带负电荷，阴离子交换剂本身带正电荷。（221页） 此法又称为分子筛层析