表达载体-大肠杆菌表达载体.ppt

西南大学生物技术专业 基因工程 * 第五章 表达载体 第一节 大肠杆菌表达载体 第二节 穿梭载体 第三节 整合载体 本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！ 西南大学生物技术专业 基因工程 * 一、大肠杆菌表达载体的结构 原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。 均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的基本要求，然后增加表达元件。 1、表达元件(expression elements)： 1）启动子(promoter)：三类，即 lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或trc，都受IPTG诱导。 T7噬菌体启动子 λ噬菌体的PL启动子。 第一节 大肠杆菌表达载体 西南大学生物技术专业 基因工程 * 2）终止子：依赖于ρ因子或不依赖于ρ因子（遇茎环结构而终止）。 3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)：Shine-Dalgarno (SD)序列，ATG与RBS之间的距离很重要，一般3-11bp。 2、表达形式 完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。 融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编码区的串联体，但构成一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。 西南大学生物技术专业 基因工程 * 3、表达的控制 诱导表达系统：IPTG 防渗漏表达系统：lacIq PL启动子受cⅠ的调控，低温(30℃)下阻抑转录，高温(40-45℃)下解除抑制。 二、利用T7噬菌体启动子的表达载体 pET系列，表达能力强，可控性好，只受T7噬菌体RNA聚合酶识别，不受大肠杆菌RNA聚合酶识别，可用IPTG诱导表达。 西南大学生物技术专业 基因工程 * 非融合型表达载体 主要元件：强启动子、SD、起始密码子ATG、万能终止密码子。 P SD Foreign DNA 非融合型表达载体 非融合基因 西南大学生物技术专业 基因工程 * 非融合型表达载体----pPL-Lamda PL启动子---温度诱导 插入位点--HpaI 西南大学生物技术专业 基因工程 * 三、表达融合蛋白的表达载体 1、GST (glutahione S-transferase, 谷胱苷肽S-转移酶)表达载体：如Amershamm公司的pGEX系列，其GST来自于血吸早虫，融合蛋白下保持酶学活性，对谷胱苷肽有很强的结合能力，融合蛋白纯化出来后用凝血蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。 2、组氨酸标签表达载体：如Novagen公司的pET系列，可在目标蛋白的N-端或C-端加上6个组氨酸的标签和Xa因子酶工位点，能与镍等二价金属离子结合，纯化目的蛋白，用Xa因子处理可得到纯的目的蛋白。 西南大学生物技术专业 基因工程 * 3、内含肽表达载体：如NEB公司的Impact-Twin系统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽(intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切除。 4、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙，可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠，或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。 信号肽(signal peptide)有碱性磷酸酶信号肽、蛋白质A信号肽（如Amersham公司的pEZZ18系统）。 西南大学生物技术专业 基因工程 * 融合型表达载体 P SD Foreign DNA 融合型表达载体 融合基因 西南大学生物技术专业 基因工程 * 技术关键：克隆基因可插入标签肽序列的3’或5’端，但必须维持正确的ORF。 选择合适酶切位点 加人工合成的DNA接头 构建位相载体 西南大学生物技术专业 基因工程 * ----ATG ---- AAC CTG GAA TTC CTA GGT --- ----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA--- EcoRI BamHI AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA 载体部分序列 DNA序列 西南大学生物技术专业 基因工程 * 位相载体----含有3种读码框的系列载体 西南大学生物技术专业 基因工程 * 优点： 表达效率高 产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定 易纯化：利用融合原核多肽的特性 西南大学生物技术专业 基因工程 * Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物，切割方便： pGEX-1?T—凝血酶 pGEX-2T--