三种不同因子对三角帆蚌外套膜细胞Ca2流动性的影响.docVIP

(三种不同因子对三角帆蚌外套膜细胞Ca2+流动性的影响 施志仪郝莹莹 李文娟 韩 健 靳雨丽 （上海海洋大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室，上海201306）关键词三角帆蚌；外套膜细胞；非损伤微测； Ca2+流动性 三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我国主要的育珠母蚌，其所培育出的珍珠色泽鲜艳、细腻光滑，因而成为目前淡水育珠生产中首选的育珠母蚌之一。外套膜是贝壳和珍珠形成的重要组织，有内外两层表皮细胞及其间的结缔组织构成。对钙具有高度通透性上皮细胞具有通过细胞膜主动吸收Ca2+和贮存Ca2+的功能，通过胞吐作用排出钙至外套膜外腔中，这些钙就是形成珍珠的基础。维生素D3促进Ca2+吸收和增加钙的运转对钙吸收起着重要作用。，适量维生素D3能够促进矿物质在贝壳中的沉积贝壳和珍珠环境钙浓度Ca2+升高，可增加外套膜组织Ca2+浓度[10]。研究表明，6080 mg/L的Ca2+浓度促进三角帆蚌珍珠质沉积此外，温度对外套膜细胞的也有影响珍珠质分泌 非损伤微技术on-invasive micro-test technology，NMT)在细胞和组织水平进行功能鉴定跨膜生物信息传递机制等方面发挥重要的作用。究。本研究运用NMT在不同浓度Ca2+、维生素D3以及不同温度的培养条件下，研究三角帆蚌外套膜细胞外的Ca2+的流动特性，以期为三角帆蚌Ca2+代谢的分子调控机制提供资料，也为日后提高珍珠培育提供理论基础。 本试验采用龄的活力较强的三角帆蚌，蚌体大小(长宽高为11 × 8 × 3 cm)，由浙江诸暨养殖基地提供，育珠蚌在小型玻璃水族缸(40 × 30 × 20 cm)中暂养，所用的都是曝气的自来水，其含钙量为mol/L。 维生素D3上海生工二甲基亚砜(DMSO)天根RPML1640培养基、抗(青霉素链霉素)、优级胎牛血清上海博升生物胰蛋白酶EDTA（Gibco公司)，全培养基(RPML1640+20%胎牛血清+双抗)，0.25%的胰酶(含有0.02%EDTA)Ca2+Hanks(C0218，碧云天)配成。恒温细胞培养箱REVCO，美国)，倒置显微镜非损伤微BI0-001系列 超净工作台苏州净化设备厂外套膜组织细胞的培养：蚌用手术刀切开蚌的闭壳肌，用无菌蒸馏水反复冲洗外套膜，采用撕裂法分离出外套膜外表皮[1]，再浸入双蒸水配制的0.01%高锰酸钾溶液中30 min进行初步消毒。然后依次用含有3个浓度梯度的双抗(青霉素+链霉素)的PBS冲洗，3个浓度梯度依次为：不添加双抗的PBS；含有200 U/ml双抗的PBS；含1 000 U/ml双抗的PBS。然后将外套膜外表皮组织剪成1 mm2的小片，浸于0.25%的胰酶(含有0.02%EDTA)中37℃消化30 min，再用含有胎牛血清的培养基终止胰酶消化细胞，将组织细胞贴于培养皿中，在26℃恒温培养箱中倒置培养4小时后再正置，添加全培养基继续培养，共培养组织份(个培养皿)。培养24小时稳定后再进行孵育测组织分成组第组为0.5 mmol/L、1.25 mmol/L、3 mmol/LCa2+流动研究[16]。由于NMT测试中，测试液必须含有所要测试的离子，因此，Ca2+测试组中Ca2+浓度不能为0 mmol/L；第组VD3储液(40 000 U/L)将细胞外测试液VD3分别调节为U/L、50U/L、100U/L、500 U/LCa2+流动研究(溶液中调节Ca2+浓度为1.25 mmol/L)；第组分20℃、26℃、30℃Ca2+的流动(每组都有3个重复样，每个样测定6个位点)。实验过程为：首先细胞培养待细胞在测定过程中能保持稳定的生物状态测定Ca2+流为0.5mmol/L、1.25mmol/L、3 mmol/L从低浓度开始添加，根据加入后的液体体积再计算第二浓度的添加量，依次类推。Ca2+流动变化，待稳定后记录数据。 细胞外Ca2+的测定：非损伤测是利用一种灌有液体离子交换剂的微电极在细胞周边进行测定，Ca2+选择性微电极在接近细胞与远离细胞的两点间(间距30 μm)往返移动(图1)。在已知距离dx进行两点测定，获得两个电压V1和V2，算出两点的浓度差，最终数据通过Fick第一扩散定律公式计算出Ca2+移动速率，数据表现形式为pmol·cm-2·s-1即每秒通过平方厘米的该离子/分子摩尔数Ca2+外排，负值表明Ca2+内流)。测定持续5 min，测试℃和30℃测定时，均为26℃。 Fig.1 Cells were monitored by non-invasive micro-test technology 数据处理：所有数据采用SAS软件GLM程序的单因子方差分析(SAS 6.12，1996)，数值表示为均值和SE，不同组间显著性分析采用Duncan多重比较及t-tes