淋巴细胞的分离及功能检测.ppt

淋巴细胞的分离及表面标志的检测 一、淋巴细胞的分离 借助其表面标志及功能差异分为不同的群及亚群 尼龙棉分离法 E-花环分离法 洗淘法 流式细胞术（FCM） 免疫磁球分离技术 二、 淋巴细胞的表面标志 CD抗原 特 异 性 CD2 E受体、全部T细胞和部分NK细胞 CD3 成熟T细胞 CD4 Th细胞、Mφ、HIV受体 CD8 Tc细胞、NK细胞的亚型 CD25 IL-2受体、活化T细胞 CD16、CD56 NK细胞 三、T细胞表面标志的检测方法 1. 免疫荧光技术 直接法：细胞+标记的McAb 间接法：细胞+McAb+荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清 流式细胞术（FCM）： 2. 免疫细胞化学法 APAAP酶免疫桥联法 3. 微量细胞毒实验 细胞+McAb+补体 APAAP酶免疫桥联法 E-花环(erythrocyte rosette)实验 外周血单个核细胞的分离 E-花环实验 外周血单个核细胞的分离原理 常用的方法是Ficoll-Hypaque （又称淋巴细胞分层液）密度梯度离心法。 　 Ficoll-Hypaque 比重：1.077±0.001 RBC和中性粒的比重：约1.09 PBMC的比重：约1.075 Isolation of peripheral blood lymphocytes by Ficoll-Hypaque gradient 实验试剂和材料 淋巴细胞分层液 SRBC悬液 肝素溶液 Hanks或RPMI-1640培养液 试管 毛细细管 玻片 显微镜 　　　人T细胞表面有绵羊红细胞受体，即E受体 ，又命名为CD2；绵羊红细胞（SRBC）表面有CD2的配体，即LFA-3，将淋巴细胞与SRBC按一定比例混合后，在一定条件下就形成一个T细胞结合多个SRBC的玫瑰花一样的花环，即E-花环，取样涂片染色、镜检计数可得花环形成率。 如置4℃至少2h或过夜，所检出的E-花环称为总花环（Et），亦即T细胞的百分率；如减少淋巴细胞与SRBC的比例，经短时间的温育即行取样涂片镜检，仍可见部分E-花环，称为活性花环（Ea）。 显微镜下的E花环 实验目的和意义 目的 * 掌握PBMC的分离方法 * 掌握用E-花环实验计数或分离外周血T淋巴细胞。 意义 * 用于评价机体细胞免疫功能。 * 用于分离外周血T淋巴细胞 分离PBMC ? 吸取PBMC加入至5ml hanks液，离心，1000rpm ,10 min ? 去上清，加入0.1ml（约1滴）SRBC ? 置于37oC水浴10min ? 低数离心，500rpm, 5min ? 吸去部分上清（约0.1ml），加1滴戊二醛固定10min ? 再加入1滴美兰染色1min ? 取1滴滴片，盖上盖玻片，高倍镜下计数花环形成率 结果判断 阳性细胞： 受检细胞周围粘附有3个或更多红细胞的判为花环形成细胞。 正常参考值 总E-花环形成率（Et）为60% ~80% 活性-E花环形成率(Ea)仅为Et 的1/3~1/2，约20％~40％ *  E-花环实验原理 E-花环实验操作骤 *