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实验植物组织中可溶性蛋白质含量的测定 ? Ⅰ 考马斯亮蓝 G – 250 染色法 一、原理 考马斯亮蓝 G – 250 （ Coomassie brilliant blue ， G-250 ）法是利用蛋白质 – 染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由 465 nm 变成 595 nm ，通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约 2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定 1 h ，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高（比 Lowry 法灵敏 4 倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 植物材料。 （二）试剂 1. 标准蛋白质溶液（ 100 μg ／ mL 牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白 25 mg ，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取上述溶液 40 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL 即可。 2. 考马斯亮蓝试剂：称取 100 mg 考马斯亮蓝 G-250 ，溶于 50 mL 90 ％乙醇中，加入 100 mL 85 ％（ W ／ V ）的磷酸，再用蒸馏水定容到 1000 mL ，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。 （三）仪器设备 分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。 三、实验步骤 1. 标准曲线的绘制 取 6 支试管，按表 26–1 加入试剂，摇匀，向各管中加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置 5 min 左右，以 0 号试管为空白对照，在 595 nm 下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 2. 样品测定 （ 1 ） 样品提取 称取鲜样 0.25 ～ 0.5 g ，用 5 mL 蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后， 3000 r/min 离心 10 min ，上清液备用。 （ 2 ）吸取样品提取液 1.0 mL （视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复 2 次），加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置 2 min 后在 595 nm 下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。 表 26-1 绘制标准曲线的各试剂加入量 试 剂 管 号 0 1 2 3 4 5 标准蛋白质（ mL ） 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水量（ mL ） 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0 蛋白质含量（ μg ） 0 20 40 60 80 100 ? 四、结果计算 （ mg/g ） ? 式中： C ——查标准曲线值， μg 。 V T ——提取液总体积 , mL 。 W F ——样品鲜重 , g 。 V S ——测定时加样量 , mL 。 ? Ⅱ Lowry 法（劳里法） 一、原理 Lowry 法是双缩脲法（ Biuret ）和斐林（ Folin ）–酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜–蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。 Lowry 法除使肽链中络氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强 3 ～ 15 倍，约是双缩脲法的 100 倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。 Lowry 法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对于不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理（如加入少量的 SDS ）。 1. 双缩脲法的原理 双缩脲（ NH 2 – CO – NH – CO – NH 2 ）在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。 双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得，操