蛋白质印迹(Western blotting)方法原理和优化.docVIP

蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化 已有 2975 次阅读 2008-6-19 10:43 |个人分类:生活点滴 Western blotting）方法原理和优化抽滤　　抽滤是一种直接将蛋白质转移到膜上的方法。利用真空使溶解的样品滤过膜，蛋白质吸附到膜上，同时样品中其它成分被真空抽走。另外，也可直接将样品点在膜表面使之干燥。随后可对固定在膜上的蛋白质进行分析。　　点印记和狭缝印记是抽滤方法的两种变型，用多支管装置将样品加到膜上成点状或狭缝图样。这些方法可用于快速定性筛选大量样品或定量分析类似样品，尤其是测试复杂分析中实验参数的适用性。　　另一种抽滤方法的变型是格栅免疫印迹，这种方法适用于高度平行的样品分析，当样品量及其优先并且不能用常规方法如ELISA进行分析时使用。格栅免疫印迹可用于表征变态反应原-特异性抗体应答，只需最小量的病人血清。当准备抽滤印迹膜时，要考虑以下方面：　　去污剂可以抑制蛋白吸附到膜上。用于样品溶解和漂洗的缓冲液所含去污剂不应超过0.05%，并且仅当必要时才能加入。　　样品体积应足以覆盖每个孔中的膜面积，但所含蛋白量不应超过膜的结合能力。　　含较多颗粒的样品可能堵塞膜孔，而高黏度样品将降低流速。所以在结合前先通过预过滤或离心除去颗粒，只将上清加到膜上。而粘性样品要用缓冲液稀释。Western印迹Western印迹含一系列步骤，包括：?? 用聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。?? 将胶上的蛋白转移到膜上。?? 鉴定膜上特定蛋白。下面将从理论和实践方面讨论Western印迹方法。用1-D或2-D凝胶分离复杂蛋白质混合物　　印迹前分离复杂蛋白质混合物的最常见方法是一维（1-D）SDS电泳，它根据蛋白质的分子量进行分离。有时用非变性电泳分离天然蛋白质。尽管这种方法通常缺乏变性电泳的分辨率，但当蛋白须保留生物活性时非常有用。　　二维（2-D）凝胶电泳用于分析细胞、组织、和体液蛋白质的组成，是现代蛋白质组学的关键技术。2-D免疫印迹可提供分子量和等电点信息，并可用于区分翻译后修饰产生的不同蛋白质形式。有些情况下只进行1-D电泳分离也可用免疫印迹对蛋白分型。分子量标准　　在凝胶中加入分子量标准或标记物可以在电泳分离后估计感兴趣蛋白质的大小。有两种类型的分子量标准：未染色和预染色。未染色分子量标准通常由天然或重组的纯化蛋白混合物组成。在凝胶或膜上显示其位置需要染色步骤。预染标准允许在电泳过程中监测蛋白分离，也可以在随后的印迹步骤中指示转移效率。然而，它们比较昂贵且加入染料会影响蛋白迁移率。预染标准在确定分子量时可能不够精确，并且蛋白质上附加的染料在转移时会影响它们吸附到膜上的能力。聚丙烯酰胺浓度　　凝胶中聚丙烯酰胺浓度可以是均一浓度或是梯度浓度。最常见的聚丙烯酰胺浓度为10%，最适合分离10-150KD范围内的蛋白质。若要分析未知蛋白或许要更宽的分离范围，推荐使用梯度胶。例如：4-12%Tris-glycine凝胶适合于30-200KD蛋白质的分离，而10-20%凝胶则能成功地分离6-15KD的蛋白质。SDS凝胶通常为1.0到1.5mm厚；但蛋白转印最好使用更薄的胶。凝胶电泳缓冲液　　最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris-甘氨酸或Tris-tricine组成。缓冲液可以包含0.1%去污剂，通常是SDS。Tris-甘氨酸凝胶可用于分离很宽分子量范围（6-200KD）的蛋白质，并可与变性或非变性条件相容。Tris-tricine最适于分离小分子蛋白质（10KD）,加样之前还需要还原变性。两种缓冲系统都与蛋白质转印PVDF膜兼容。Tris-乙酸缓冲液有时被用来分离大分子蛋白。将蛋白质从凝胶转移到膜　　蛋白质从凝胶转移到膜上的过程中同时保持它们的相对位置和分辨率，这被称为印迹。印迹可以以三种不同的方式实现：　　简单扩散：将膜放在凝胶上，同时放一沓干滤纸在膜上，并在滤纸上放置重物以加快扩散过程。这种方法可用于将蛋白质从一块凝胶上转移到多个膜上，同一凝胶可得到几个印迹膜。扩散法的主要缺点是不能定量转移，与电转比较只能转移25-50%的蛋白质。　　真空辅助溶剂流动：用泵的吸力将分离的蛋白质从凝胶转移到膜上，高低分子量的蛋白质都可以用这种方法转移；然而，分子量小于14KD的蛋白质需要用较小孔径的膜（0.2um），因为它们不易被0.45um膜吸附。很少从聚丙烯酰胺凝胶中真空转印蛋白质，而从琼脂糖中转移核酸则常用此法。　　电洗脱或电转移：最常用的转移方法，与扩散或真空印迹相比，其主要优点是速度和转移更完全。电转移方法　　两种常用的电转移方法是湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。　　湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入