土壤微生物的分离与纯化实验.docVIP

实验八 土壤微生物的分离和纯化 1．了解从土壤中分离与纯化微生物的基本原理及方法。 2．掌握几种常用的分离的基本操作技术。 二、原理 三 1．牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏l号培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基。 2．盛有100毫升无菌水的三角瓶，9毫升无菌水的试管，无菌吸管，无菌玻璃涂抹棒，10％的酚液，25％的乳酸，土样，接种环，标签。 四1．制备土壤稀释液 称取土样10克，放入装有玻璃珠和100毫升无菌水的三角瓶中，振摇15—20分钟，使土与水充分混合，将菌分散，静止片刻，用吸管从中吸取1毫升土壤悬液注人盛有9毫升无菌水试管中，吹吸三次，并振摇使之充分混匀，然后再吸取1毫升注入另一支盛有9毫升无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、l0-3、10-4、l0-5……的各种稀释度的土壤悬液。 2．倒平板 将牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，马铃薯蔗糖培养基溶化。待冷至50—60℃时，在高氏l号培养基中加入10％酚2滴，在马铃薯蔗糖培养基中加入25％乳酸2滴，然后分别倒平板，每支培养基倒一皿(用右手持盛培养基的试管，左手拨出棉花塞，试管口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿在火焰附近打开少许，迅速注入培养基，加盖后轻轻摇动培养皿使培养基均匀分布，平放在桌面上，待凝后即成平板。(见图18)。 3．涂抹 将上述每种培养基平板标上10-3、10-4、10-5稀释度，然后用无菌吸管分别从10-5、10-4、10-3稀释度的试管中吸取土壤悬液，每一平板注入0.2毫升，再用灭菌玻璃涂抹刮棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，静止5分钟。 4．培养 将培养皿倒置，放在28℃温箱培养。 5．移接 将培养后长出的单个菌落分别移接到三种斜面培养基上，28℃下培 图17 接种工具 图18 倒平板 图19 从土壤分离微生物的操作过程 (二)平板划线分离法 1 2．划线：右手拿接种环，从上述10-1的土壤悬液中取一环，左手托培养皿，并在火焰附近打开盖少许，在培养基平板表面轻轻划线，划线方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品进一步在平板上稀释分散，使形成单独的菌落。划线的方法（如图20），具体方法如下： (1)取一环菌样先在平板上划平行线至一半，然后将接种环上剩余菌烧死，培养皿转动90°角，通过第一次平行线划线，划完后盖上皿盖，倒置培养。 (2)取一环菌样后先在平板上作几条平行线，再将培养皿转动70°角。，把接种环上剩余的菌烧死，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行线，再用同法通过第二次平行线作第三次；第四次平行线。划完毕后，盖上皿盖，倒置培养。 图20 划线分离方法 五、实验结果 10^浓度 细菌 放线菌 酵母菌 霉菌 PDA 7 2 13 2 高氏一号 1 7 6 1 NA 4 2 13 2 六、思考与讨论 1．3-5天后统计3种培养基平板上长出的菌落数，确定最佳稀释浓度。初步判别各培养基上长出的菌落属于分别哪个类群？简述它们的菌落形态特征。 最佳的稀释浓度为10^-5培养基长出的菌落分为：放线菌，细菌，酵母菌，霉菌四大类。放线菌的形态特征为干燥，小而紧密，颜色多样。细菌的特点是湿，小而突起或大而平坦。酵母菌的特点是较湿，菌落大而突起。霉菌的特点是干燥，菌落大。 2．划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？ 将接种环上多余的菌体烧掉是为了 3．培养时为什么要将培养皿倒置培养？ 防止冷凝水滴下冲坏自然形成的菌落，影响观察。拿出观察时方便，防止平皿底滑落。防止杂菌落入。 4.在倒完平板之后一定要等待一段时间，等培养基冷却下来，凝固好之后再进行涂布平板以及划线，否则涂布平板以及划线的操作会把培养基弄破，影响最后的实验结果。 5.涂布平板和划线时都要注意卫生，事先都要进行高温灭菌处理，否则会造成其他细菌的污染。 6.刚开始倒平板的时候手可能会有些发抖，多练习几次就好很多了。