土壤中放线菌的分离和纯化.docVIP

土壤中放线菌的分离与纯化 实验目的 1掌握放线菌的生长特性，微生物的培养方法。 2掌握微生物实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术，纯种分离技术，纯种培养技术，以及抗生素检测等。 3掌握合成培养基，选择培养基的制备方法。 4学习对微生物实验的中出现问题的分析，解决方法 实验材料 药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。）高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O 作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成套平皿2. 土壤中放线菌的分离1．编号，分装：取套无菌平，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-310-4、10-5）。每个稀释度做个培养皿。然后在每皿中倒入已50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。　ml一只盛有10ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 　2 　土样放入振荡10min，即10-1的土壤悬液，静置30s。 用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。 　　　45℃左右的高氏培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固。（若融化的培养基温度太高，会产生太多的冷凝水，影响观察。） 　　1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀 稀释涂布平板法 　接种完毕，将平皿放入28℃恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。 1、倒平板 2、 划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种： 图Ⅴ-3 划线分离示意图 ⑴分区划线 用接将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁刮取少许菌苔，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线(图Ⅴ-3)，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。 ⑵连续划线 将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线(图Ⅴ-4，B)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置28℃培养。 V—4划线分离示意图 拮抗实验 长出菌落后，要判断是否已分离到了纯菌种。 1配置鉴别培养基 配置金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养基。 2标号 在两平板上标注均匀间隔的7个区域。 2挑菌落 在纯培养的平板上切取生长较好的放线菌落依次放入标注区域中（在火焰旁切取），置于28℃恒温箱培养天、、、表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱孢子丝生长到一定阶段可形成孢子由于孢子含有不同色素，成熟的孢子堆也表现出特定的颜色，而且在一定条件下比较稳定，故也是鉴定菌种的依据之一。孢子的形态和大小不能笼统地作为分类鉴定的重要依据。、稀释倒平板法