PronaseE酶解释放糖蛋白N糖链的方法及荧光标记衍生物的LCMS分析.pdf

V01．3l 高等学校化学学报 No．10 20lO年lO月 CHEMICALJOURNALOFCHlNESEUNⅣERSmES 19912一1998 Pronase E酶解释放糖蛋白N-糖链的方法及 荧光标记衍生物的LC-MS分析 徐莎1，张萍1”，黄琳娟1，王仲孚1 (1．西北大学生命科学学院，西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，西安710069； 2．咸阳师范学院化学与化工学院，咸阳712000) 摘要建立了一种用非特异性酶链酶蛋白酶E(Pmrme E)从糖蛋白上释放N．糖链的方法．以牛胰核糖核酸 酶B(mb0B)和鸡白蛋白(chicken 当蛋白酶质量与糖蛋白质量比为1：l时，得到只带一个天冬氨酸(Asn)的闭环N．糖链，称其为糖氨酸(dy． c帅一Asn)，这样既为糖链引入了天然的一NH：活性基团，同时还保持了糖链原有的还原端闭环结构．以9．氯 甲酸芴甲酯(Fmoc—c1)为衍生试剂对解离后的糖氨酸进行衍生，采用高效液相色谱．电喷雾质谱联用技术 衍生以及糖氨酸衍生物的HPLc·EsI／MS分析方法，该方法保持了N-糖链的天然结构，便于以一N心为功能 基团进一步进行荧光标记、分离制备以及糖链与蛋白质的相互作用研究． 关键词Pmna眈E；糖蛋白；9-氯甲酸芴甲酯；电喷雾质谱；荧光标记 中图分类号0629．7 文献标识码A 文章编号0251聊90(2010)10．1992J盯 构更加多样，功能更加复杂，并且由于生物合成的非模板性和结构的微不均一性，使糖链具有了更多 的分支结构、连接方式和空间构象，因此修饰后的糖蛋白会产生多种生物活性，对生物体的生长、发 育甚至对生物体的生存起着至关重要的作用．一些重大疾病的发生也与糖基化异常相关心．3]．蛋白质 的糖基化与体液免疫和细胞免疫息息相关【4J，其中的糖链参与了B细胞的活化、抗原的处理与递呈等 过程，并且可影响免疫球蛋白的结构与功能，调节T细胞活化与凋亡．但目前阶段还不能在完整糖蛋 白的水平上对糖链的详细结构信息进行研究，而需先从多肽骨架上释放寡糖链，再进一步研究糖链结 构与功能的关系． 目前，N一糖链主要是用N一糖苷酶F(PNG鹊eF)1酶解，再结合后续的毛细管电泳(cE)、高效液相 色谱(HPLC)和质谱(MS)等技术对其进行分析．经PNG柏e F酶解能够得到完整的N一糖链和肽段，但 由于糖链本身没有发色基团，不能直接用高灵敏度的检测方法如CE，HPLC及LC．MS等进行分析，因 此需要通过柱前衍生法使糖链带上紫外或荧光基团．衍生化后糖链的疏水性增加，易于在色谱柱上保 留，还可提高质谱的灵敏度．在众多衍生化方法中∞J，还原胺化法由于产物稳定而成为常用的衍生化 方法之一．该方法一方面可对糖链的还原端直接进行标记，而原糖链的回收比较困难，并且衍生后的 糖链会形成还原端开环结构一J，导致糖链的部分生物信息丢失以及对糖链的一些活性造成影响哺1；另 杂，糖链损失较大． 收稿日期：2009—12珈． ∞J帱93)和陕西省重点实验室重点科研计划项目(批准号：09JS081)资助． 联系人简介：王仲孚，男，博士，教授。博士生导师，主要从事糖生物学与糖工程学研究．E—ail：—嘴dl俺n椰．础-．m 万方数据 1993 No．10 徐 莎等：Prona盼E酶解释放糖蛋白N-糖链的方法及荧光标记衍生物的LC-MS分析 得到肽段长短不一的糖肽，再对其氨基直接衍生，进而将其应用到糖芯片的研究中．另外，An等¨训利 用Pron鹊eE酶解得到带有多个氨基酸的糖肽，通过与PNG鹪eF酶解释放的糖链比较，对N一糖链的糖 基化位点进行了研究．但这些方法均得到肽段长短不一的糖肽，影响了对糖链的进一步分析． 本实验在前期研究的基础上，以牛胰核糖核酸酶B(RiboB)和鸡白蛋白(Chic