哈维氏弧菌GST、GPx疫苗制备及对斜带石斑鱼的免疫保护作用.pdf

哈维氏弧菌GST、GPx 疫苗制备及其对斜带石斑鱼的免 疫保护作用 摘 要 哈维氏弧菌是一种栖息在水生和海洋环境的革兰氏阴性细菌，影响许多水产养殖 动物。它是甲壳类动物和诱导养殖对虾发光弧菌病的病原体，它也是一种鱼类病原菌， 感染多种物种，给海水养殖业带来严重的经济损失。目前，水产养殖控制弧菌病主要 是依赖抗生素，但由此带来的各种副作用如细菌耐药性，环境污染相关联以及食品安 全危害日益明显。近几年，人们转向了从基因工程方向来防治弧菌病。 生物体在代谢过程中会产生少量的自由基，体内的抗氧化系统（抗氧化剂和酶类） 能及时清除从而维持自由基代谢平衡。在生物体内，常规生理浓度的活性氧（ROS ） 是维持正常细胞生理功能所需的，而过量的ROS 则会对生物分子造成伤害。超氧化物 歧化酶（SOD ）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和谷胱甘肽硫 转移酶（GST）等组成了体内微型抗氧化系统，在维持生物体内活性氧（ROS ）的平 衡具有非常重要的作用，能有效保护细胞免受氧化损伤。 本研究通过同源引物从哈维氏弧菌ZJ0603 基因组扩增得GST 和GPx 基因ORF， 将两个基因分别克隆 pMD-18T 载体测序，并进行生物信息学分析。GST 基因 ORF 全长615 bp ，编码204 个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸序列经过Blast 对比，该基因 与Owensii 弧菌、轮虫弧菌、坎贝尔弧菌的序列相似性分别为99%、99%、97% 。GPx 基因ORF 除去信号肽全长477 bp ，编码 158 个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸序列经 过Blast 对比，该基因与Owensii 弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌的序列相似性分别为99%、 99%、97% 。 将两个基因分别亚克隆到原核表达载体pET-28a（+ ），构建原核表达质粒pET-GST 和pET-GPx，且在大肠杆菌BL21 （DE3 ）中获得大量表达。GST 在37℃、4 小时、 IPTG 浓度0.08 mmol/L 表达量达到最高；而GPx 在37℃、6 小时、IPTG 浓度0.1mmol/L 表达量达到最高。通过镍亲和层析分离纯化GST、GPx 蛋白，SDS分析表明， 纯化的蛋白为单一条带，分子量分别为28.2kDa 和22.2kDa 。 通过腹腔注射纯化的重组 GST 、GPx 蛋白免疫斜带石斑鱼，5 周后用致病性 V.harveyi 进行人工感染试验，对斜带石斑鱼的免疫保护率分别为72.5%、77.5% ；ELISA 检测结果表明，所有试验组鱼都可检测到抗体，而且在第35d 抗体达到峰值，表明这 两个基因具有较好的免疫保护效应。 针对哈维氏弧菌 GST 、GPx 基因分别构建真核表达质粒 pcDNA -GST 和 pcDNA -GPx，并通过肌肉注射斜带石斑鱼。并通过从DNA 水平和mRNA 水平检测两 种质粒在鱼体组织内的表达分布情况。结果显示：免疫接种后的 7d 和 28d ，注射点 I 周边肌肉、肝、鳃、头肾和脾脏组织均有目的基因表达；ELISA 和Western-blot 结果 表明，鱼血清内存在抗体，说明两种DNA 疫苗免疫后鱼体表达了目的蛋白，并诱导 产生了相应抗体。在攻毒试验中，重组质粒pcDNA -GST 和pcDNA -GPx 免疫保护率分 别是80%和82.5%。 关键词：哈维氏弧菌，石斑鱼，谷胱甘肽硫转移酶，谷胱甘肽过氧化物酶，疫苗 II Construction and Protection Ealuation of Vccines Cntaining GST and GPx of Vibrio harveyi on Orange-spotted Grouper (Epinephelus coioides) Abstract Vibrio harveyi is Gram-negative bacterial