Northern Blot注意事项.docx

DIG检测试剂盒疑难问题及解决方案 一、灵敏度低或信号弱的问题及解决方案？ 探针标记效率低： 膜的问题：使用阳性尼龙膜 杂交：增加标记探针的浓度，或减少洗涤时的严谨性 曝光时间：增加曝光时间；使用高灵敏度的专用化学发光的Lumi-Film胶片，其他像Kodak XAR也可。 二、高背景解决方案? 探针标记：纯化的DNA或RNA在标记前用乙醇沉淀；确认探针对靶序列是特异性并跟其他载体无同源性； 膜：推荐使用罗氏或经过验证的膜(pall)、Ambion 膜 杂交：使用CDP-Star发光底物，最好将DIG探针浓度稀释到（RNA 20-50ng/ml） 另外在杂交过程中不要让膜干燥 检测过程：将抗DIG-AP的酶的浓度到由原来的1:20,000 减少到1:50,000，也不会减少酶检测的灵敏度。增加洗脱和封闭的溶液的量和次数；膜上出现斑点可能是由于酶在膜上的凝集，需要将膜短暂离心后使用。 曝光时间：缩短曝光时间，通常为15-60s。 Ambion生物素化探针疑难问题解决方案 一、探针类型、设计及标记方法 （一）探针类型如何选择？ 1.单链DNA探针：对于传统的杂交缓冲液，单链探针的效果要好于双链探针，因为双链探针可与未标记的RNA结合，降低了探针与靶RNA结合的浓度，使杂交信号减少，另外双链探针之间可以退火，降低探针的浓度。 引物延伸法：质粒克隆或PCR产生的模板 非对称扩增PCR: 末端标记的寡核苷酸；优点:简单、经济，对于同源性较高的序列或对靶基因序列了解较少情况下适用。通常在5’末端用多聚核苷酸激酶标记，但每一个分子仅有一个可标记的基团，比内部掺入标记的探针灵敏度更低，且杂交温度需要去摸索。 2.双链DNA探针：有高度特异性，能用于随机引物进行标签，快速和可靠。缺点是;在杂交前需要变 性。 3.RNA探针：质粒克隆表达或PCR产生的DNA模板进行体外转录合成RNA探针。 （二）探针设计原则; 1.探针需在反义链上：才能跟mRNA互补,启动子应在3’末端编码区 。双链RNA探针需含有意义链和反义链。合成单链探针时要考虑合成的是反义RNA，启动子应在3’末端。下图示意选择启动子的位置;在反义链3’端使用启动子1产生的正义RNA探针，在反义链5’端使用启动子2产生的反义链RNA探针。 2.探针长度：在100-1000之间，大于1000则产生高背景,很难区分异源序列。如果用随机引物标记，探针长度为模板长度的一半。如果模板长度少于100，杂交温度和洗脱则按照寡核酸的条件进行。 3.探针序列：探针应含有最少的非同源序列（如载体序列、内含子等），也应含有最少的同源序列。探针尽可能含有跟模板误配的碱基。 4.标记：放射性或非放射性标记。 5.寡核苷酸探针：至少15bp,但标记效率差，灵敏度低。每一个杂交分子只有一个标签分子。 （三）探针制备方法 1.随机引物标记法：通过切口平移或随机引物方法。质粒载体上的DNA或CDNA模板通过内切酶消化后再通过胶回收纯化。如果载体序列被标记了会产生高背景。这种方法要求模板的量不要过量，否则过量的模板会反过来与标记的模板竞争结合靶序列，减少了信号。 2.体外转录法：质粒上的模板应该内切酶消化后，尽量避免过多的载体序列。单链RNA探针用DNA酶消化后去除模板DNA。 3．PCR 法：包括线性扩增和不对称PCR。线性扩增PCR只使用单一引物，一定要去除未结合的核苷酸。不对称PCR可使用上下游引物。但下游引物浓度更高有利于合成反义核苷酸。可使用PCR或反转录PCR为模板。 4.引物延伸法： 二、杂交温度的优化 1.RAN 探针：在高温68℃，高AT含量或与靶基因出现多个误配的探针，可能杂交失败。如果在此温度信号较弱，尽量减少杂交和洗脱温度至60℃. 2.DNA探针：如果在42度有交叉反应(非特异性带)，则增加温度到45-48℃. 3.寡核苷酸探针;有较低的Tm值，如果在37℃杂交信号弱或无信号, 则用等量的2.5×SSC/7%SDS稀释杂交液,再回复到37-42℃杂交和洗脱。 (二)条带高背景的原因 低于最适的杂交温度：如DNA探针温度为42℃，RNA探针为65℃，如低于此温度会出现高背景或交叉反应。杂交温度需凭经验来确定 探针浓度太高:如RNA探针浓度为0.1nM ,DNA化学标记法浓度为1pM ，内部参入法为10 pM，放射性标记为106cpm/mL.使用更高浓度的探针，尽管克提高信号，但同时也增加了背景。 探针含有其他的序列 (三) 条带及膜背景均高的原因 预杂交时间太短：低于30min 暴露时间过长：化学显色法最佳的显色时间通常为1-30 min.可以通过在不同时间、次数来得到最好的信噪比 探针中含有游离的核苷酸未能去除：未参入的游离核苷酸，可导致高背景 杂交缓冲液没有完全溶解：应将杂交液在68℃预热