生物技术制药第版第六章酶工程制药分析.ppt

20世纪90年代，借助基因工程技术，可经过酶基因重组，利用微生物表达生产酶制剂。 基因工程+发酵技术+发酵设备 学生授课 结合课本和酶工程所学内容，请各位同学按照以下分组情况准备20min左右的授课内容及ppt（下周一每组选1位同学在课堂上进行讲授），计入平时成绩。 酶制剂的来源及制备（1-10号） 酶的分离纯化（11-20号） 酶与细胞的固定化（21-30号） 酶反应器（31-41号） (一) 核酶的发现 上世纪80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的Thomas Cech和美国耶鲁大学的Sidnery Altan各自独立地发现RNA具有生物催化功能，从而改变了生物催比剂的传统概念。 T.Cech和S.Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。 T.Cech的研究工作 S.Altman的研究工作 启示： T.Cech为什么能发现RNA的催化作用并获得诺贝尔奖？ 如果你是一个不为常识所束缚的人，那么，你有可能获诺贝尔奖 S.Altman为什么能发现RNA的催化作用并获得诺贝尔奖？ 如果你能根据别人刚刚发表的成果马上修正自己的研究工作，那么，你有可能获诺贝尔奖。 核酶/脱氧核酶面临的问题 二、在药用酶生产中的应用 （三）其他 帕金森症 戈谢病 溶菌酶与抗生素联用 复习思考题 1. 突变酶、抗体酶的定义及制备方法。 2. 酶分子的定点改造的定义及制备方法。 3. 酶分子定向进化的定义及制备方法。 4. 回顾酶工程相关内容，了解酶工程在药物生产中的应用。 * * * 应用 1. 提高酶活性及稳定性 阐明酶分子中某一基团的功能 2. 研究酶的功能基团 酶同源序列的比较 选择突变靶标 化学修饰 酶的二、三级结构 六、酶分子的定向进化 以已知的亲本野生酶为起点，经过随机的基因突变或重组，构建一个包括多种突变酶基因的蛋白酶文库，在此基础上进一步通过定向的选择性筛选，从中获得具有某些定向功能或性状的酶分子 非理性分子设计 原理：人为模拟自然进化机制，利用分子生物学手段结合灵敏的筛选技术，获得具有某些预期特征的进化酶。 方法 1. 随机突变 易错PCR：通过改变PCR的反应条件使碱基一定程度上随机错配，导致目的基因随机突变，构建突变库，筛选突变体。 2. 同源改组 有性PCR：亲本基因群中的优化突变 3. 非同源改组 渐进切割杂合酶技术：用核酸外切酶对两个亲本基因分别进行消化，再将两组片段化基因互相连接 方法 4. 结构域改组 利用内含子之间的重组使独立的外显子组装成编码新蛋白质的基因 5. 其他技术 酶法体外随机-定位诱变技术 酵母细胞重组增强组合文库技术 筛选策略 底物显色反应 改变培养条件 利用蛋白固有性质 高通量筛选 固相筛选 放射性染料筛选 荧光筛选 ELISA 七、酶分子的化学修饰 限制药用酶临床应用的因素： 对生产条件的要求高 具有一定免疫原性 受体内蛋白酶水解影响 理化和生物稳定性差 酶分子修饰的种类 1. 金属离子置换修饰 2. 酶分子的化学修饰 3. 酶分子的物理修饰 1. 酶的表面化学修饰 （1）大分子结合修饰 （2）侧链基团修饰 2. 酶分子内部修饰 （1）肽链有限水解修饰 （2）核苷酸链剪切修饰 （3）氨基酸置换修饰 （4）核苷酸置换修饰 酶分子的化学修饰 大分子修饰酶的应用 PEG-超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD） PEG-溶血类蛋白质（链激酶Streptokinase, SK;尿激酶urokinase, UK等） PEG-天门冬酰胺酶（Asparaginase, ASNase） 消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期 用Dextran修饰?-淀粉酶，??-淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶：提高了酶的热稳定性。 第四节 酶工程技术在制药工业中的应用 酶工程制药优点 工艺简单、效率高、生产成本低。 环境污染小、产品收率高、纯度好。 一、在生物转化中的应用 二、在药用酶生产中的应用 6-氨基青霉烷酸 （6-APA）：青霉素G水解除去侧链后的产物，也称无侧链青霉素。 生产半合成青霉素的最基本原料。 （一）在抗生素工业中的应用例：固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 青霉素酰化酶：用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变pH等条件，既可催化生成6-APA，也可催化6-APA与其他的羧酸衍生物进反应合成具有不同侧链基团的青霉素 固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 技术路线 固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 E.coli 斜面 细胞 固定化细胞