PCR及SSCPPAGE技术教案.ppt

电泳完毕后，撬开玻璃板，将粘有凝胶的玻璃板置于塑料盘（不要碰凝胶表面！） 用蒸馏水漂洗两次，并取出玻璃板 去水后，用10%乙醇进行凝胶固定 10 min，轻摇 去乙醇，水洗、加入1%硝酸，轻摇5min 吸出硝酸，用蒸馏水漂洗2次 实验操作及注意事项 （下列加液量以刚好覆盖凝胶为宜） 加入0.2%硝酸银溶液，轻摇20min 蒸馏水漂洗3次 去水后，加入显色液，在非直射光线下观察显色 观察区带出现，效果最佳时移除显色液 加入3%乙酸，轻摇5min 移除3%的乙酸溶液，10%乙醇洗涤1次 观察结果? 结果分析与问题讨论 SSCP影响因素 1．用于分析的核酸片段越小，敏感性越高，一 般 150-300bp 2．游离的引物可与PCR产物结合影响其泳动 3. 保持胶内温度恒定可保证SSCP结果的稳定 4. 凝胶的长度: 一般凝胶板长度在40cm以上 6. 关于对照的设置。判断突变时一定要有阳性对照。假 阴性结果是SSCP的主要缺点 7. 结果分析：结果至少显示3条带，甚至可以出现更多条 带（一种DNA单链有时可形成两种或多种构象） 。 利用物质的两个差异来分离物质 电荷差异 电荷性质 电荷数量 分子差异 分子大小 分子形状 二、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳 电泳及其基本原理 常用的电泳方法 琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分离、鉴定和纯化） 三、DNA琼脂糖凝胶电泳原理 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带上负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、构象、分子量不同，它们在通过凝胶立体网络是所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，达到分离的目的。 四、DNA琼脂糖凝胶电泳实验操作 实验目的及意义 1. β-actin基因扩增产物的鉴定 2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳实验方法 实验材料及试剂 材料：β-actin基因扩增产物 试剂： 1% 琼脂糖凝胶（配制方法） 电泳缓冲液： 1? TAE （ 10 ? 上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、甘油） 溴化乙锭 （其它荧光染料如花青类染料 SYBR Green I 及GoldView等） 琼脂糖凝胶板的制备（凝固后拔梳） 琼脂糖凝胶板的放置（加样孔在负极） β-actin 扩增产物10ul＋2ul上样缓冲液 (每块胶留一孔加Maker10ul)，电泳（100V,约1h） 紫外检测 实验操作及注意事项 50bp 100bp 200bp 300bp 400bp 实验三 PCR产物SSCP－PAGE分析 SSCP原理 单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而在电场中迁移率不同，在聚丙烯酰胺凝胶中分子筛效应不同。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开，为DNA单链构象多态性 (Single-Strand Conformation polymorphism，SSCP)分析. SSCP检查PCR扩增产物的基因突变十分广泛。 SSCP特点 1．DNA长度为150-300bp(本实验中HLA-DRB扩增片断为227bp)突变体检出效率最高。 2．理论上讲SSCP能够100%的检测出突变体。(70—80%) 3. 要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序 PCR-SSCP基本过程 1．PCR扩增靶DNA。 2．PCR产物的快速变性而后快速复性，形成特定 空间结构的DNA单链分子。 3. 非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 4. PAGE胶的银染 PCR-SSCP结果判定 单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，存在碱基突变. 有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难 看出两者之间的差别,因此一般要求电泳长度在16--18cm以上. 以检测限为指标来判, 检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值,一般检测限定为3mm。大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化。 SSCP应用