多聚酶链式反应扩增DNA片段(人教版选修)解析：.pptVIP

专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片断 1、DNA分子的组成成分和结构 DNA 分子的基本组成单位是 .共有 种,每个基本单位是由一分子的 、一分子的 、和一分子的 构成。 脱氧核甘酸 4 磷酸 碱基 脱氧核糖 那么DNA分子的平面结构怎样呢？ 一 、基础知识 2.DNA分子的平面结构 A T G C A G C T 氢键 5'端 3'端 5'端 3'端 识别 ： DNA分子的3′ 端与5′ 端 -OH端为3′ ; 磷酸基团的末端为5′。 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 总结：胞内DNA复制的基本体系 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 ㈢.PCR(多聚酶链式反应） 2.DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。 3.DNA聚合酶作用过程 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 1.定义： 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 4.PCR原理 ⑴.在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。 ⑵.当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。 ⑶.PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。 5.Taq DNA聚合酶的应用 6.需要为PCR反应提供的物质 缓冲液、DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、 简便、重复性好、易自动化等突出。 7.PCR技术的特点： DNA双链 单链 变性（加热80-100℃ ） 复性（缓慢冷却） 3、DNA 分子的热变性原理： 变性的目的： 复性的目的： 解开双链 有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合 每个循环包括：变性 ——复性——延伸 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 PCR的反应过程 二、PCR的反应过程 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 3/ 引物Ⅰ 5/ 3/ 引物Ⅱ 变性95oC 复性55oC 延伸72oC 5/ 3/ 3/ 5/ 5? 引物1 5? 引物2 第二次复制 第一次复制 5? 5? 5? 5? 5? 5? 模板DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。 三、 PCR反应的实验操作 1、PCR仪 设备及用具 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 实质上一台能够自动调控温度的仪器 1.准备 2.移液 ㈡.实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。 混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。 3.混合 ⑴过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。 4.离心 ⑵离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。 四、结果分析与评价 DNA 含量的测定：稀释→对照调零→ 测定→计算（公式见P63） 波长260nm处读数 蒸馏水做对照 50倍 （一）理论上DNA扩增数目的计算 四、课题成果评价 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n （二）实验中DNA含量的测定 1 、原理 可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关 2 、过程 ①稀释 2μL PCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释