第七章PCR技术.doc

PCR技术 Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应 PCR的最早设想 ： 1971年，Korana最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因”。 PCR的实现：1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis等人发明了PCR，又称为基因的体外扩增法。 1985年公开报道 1987年PCR得到美国的专利权 1989年PCR技术被“Science”杂志评为十大科技新闻之一 1993年Mullis因发明了PCR而获得诺贝尔化学奖 第一节 PCR技术的基本原理 一、 PCR技术的基本原理 依据体内DNA的半保留复制机理及DNA分子在不同温度下双链和单链可以相互转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成两条单链DNA，单链DNA用4种dNTPs在引物和DNA pol的作用下合成新生的DNA互补链。 二、PCR扩增过程 1、高温变性 在高温条件下，使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA变成单链DNA 变性温度： 94-97℃，常95 ℃ 30-50s，常30s 2、低温退火 当温度降低时，由于模板分子的结构较引物复杂，且反应体系中引物的量大大多于模板DNA，使引物与其互补的模板在局部形成杂交链。 退火温度： 25-60℃，常55℃ 60-90s，常60s 3、适温延伸 在DNA pol和4种dNTPs底物及Mg2+存在的条件下，pol催化以引物位起点的DNA链的延伸反应 延伸温度： 70-74℃，常72℃ 60-120s PCR的反应动力学 理论上为2n。 30次循环，DNA产量达109拷贝 实际上为(1+R)n。R为扩增效率，平均为75% 30次循环，DNA产量实际为106-107拷贝 三、PCR技术的特点 高度的敏感性 高度的特异性 操作简便、快速 适用样品的广泛性 第二节 PCR反应体系中的各组分分析 一、引物 引物的设计决定PCR反应的成败 PCR的效率和特异性取决于： 1、引物与模板的特异结合 2、聚合酶对引物的有效延伸 引物设计原则 1、引物长度以16-30为宜 引物过短，特异性降低 引物过长，成本增加，PCR的最适延伸温度会超过Taq DNA pol的最适温度 若引物长8bp，则平均每隔48=65536bp就有一个结合位点。人大约有43000个可能的结合位点 若引物长16bp，则平均每隔416=4.29×109bp有一个结合位点。 2、引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段 3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 4、碱基分布的随机性：ATGC随机分布，避免5个以上的相同碱基成串排列。尤其是引物的3‘端，不应有连续3个G或C 5、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 6、两引物之间不互补，一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体 7、引物3‘端是引发延伸的点，不应错配：由于ATGC引起错配有一定规律，以引物3’端A影响最大，因此，3‘端的末位碱基最好选TCG，而不选A。 8、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源 9、引物5‘端可以修饰 加酶切位点； 用生物素、荧光物质、地高辛等标记； 引入突变位点； 引入启动子序列； 引入蛋白质结合序列 5‘端修饰后不影响正常的PCR反应 引物的保存和使用浓度 冻干，-20℃，可保存1年，常保存6月 使用最终浓度：0.2-1.0μmol/L，适宜 小于0.2μmol/L，影响产量 大于1.0μmol/L，不经济，出现非特异性扩增产物和引物二聚体 二、DNA Pol Mullis最初使用的DNA聚合酶是E.coli DNA pol I 的Klenow片段 缺点： 1、Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。 2、引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA pol进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 T7 DNA pol 1976年，Chein分离出一种热稳定的聚合酶 1986年，Erlich从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离并纯化了Taq DNA pol，生长在70-75℃极富含矿物质的环境中 1988年，R.K.Saiki等成功将Taq DNA pol应用于PCR。 水生栖热菌(The