南方医科大学正交试验法优化啤酒花中黄酮成分的提取以及提取物生物学活性的研究2010-5-9分析.doc

正交试验法优化啤酒花中黄酮成分的提取以及提取物生物学活性的研究 南方医科大学第二临床医学院临床五年制08级 王略力 南方医科大学第二临床医学院临床五年制08级 谢宝树 南方医科大学第二临床医学院临床五年制08级 熊浩 摘 要 对啤酒花黄酮类化合物的提取工艺进行优化研究，用正交试验对提取溶剂乙醇含量、料液比、提取温度及提取时间进行研究，在此基础上确定上述 4 个因素的最佳组合。并对黄酮类化合物的性质进行研究。 关键词： 啤酒花；黄酮；正交法；抗凝 前言 啤酒花 Humunus lupulus L1 是桑科草属多年生草质蔓生藤本植物，其雌性球穗花序简称酒花【1】。干燥的雌性酒花用于酿制啤酒，能赋予啤酒特有的香味、 爽快的苦味，并能增加啤酒的防腐能力和非生物稳定性。酒花还是一种药用植物，国外将其用于治疗癔病、 失眠等，《中国药典》1977 年版上记载酒花的乙醇浸膏用于治疗肺结核病和麻风病等症。 啤酒花含黄酮苷、 黄酮醇及异戊二烯基查儿酮。前二者广泛存在于植物界 ,后者由酒花的蛇麻腺分泌,能抑制癌细胞的体外扩增【2】、甘油二酯酰基转移酶的活性【2】,并有抗菌及雌性激素样功能【3】。 本实验选择乙醇为提取溶剂，通过正交试验【4】，研究啤酒花总黄酮的最佳提取条件（提取溶剂乙醇含量、料液比、提取温度及提取时间），以能在适量的原料上最大量的提取啤酒花中的黄酮，然后通过实验检测黄酮提取物的抗血小板凝集的性质。 2、实验目的 2.1使用正交试验法对啤酒花中黄酮类化合物的提取工艺进行优化研究。 2.2 啤酒花中黄酮类化合物抗血小板凝集性质的研究。 3、实验原理 3.1黄酮类化合物特性 黄酮类化合物易溶于有机溶剂，例如甲醇，乙醇，故可以用甲醇，乙醇等将之溶解并提取出。 3.2正交试验法 用正交试验对提取溶剂乙醇含量、料液比、提取温度及提取时间进行研究,在此基础上确定上述4 个因素的最佳组合。 3.3测黄酮含量的原理【3】 在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下, 黄酮类化合物与铝盐生成螯和物,加入氢氧化钠溶液后显红橙色, 在510nm波长处有吸收峰。 3.3啤酒花中黄酮类提取物抗血小板凝集原理 黄酮类化合物对抑制血小板凝集有一定功效，对凝血因子具有较强的抑制作用，故表现出较好的抗凝血作用。黄酮类化合物对5-羟色胺和ADP联合诱导的血小板凝集有抑制作用:电子天平，电子分析天平，小试管（12个），试管架，圆底烧瓶（150ml，6个），球型冷凝管（6个），烧杯（50ml6个，125ml 4个），铁架台（6个），铁夹（12个），电热恒温水浴锅（三孔，两台），滤纸，容量瓶（25ml 4个,100ml 4个），胶头滴管，吸耳球，刻度吸管（10ml），玻璃棒，离心机，分光光度计 UV-1100 上海美谱达/上海，抽滤装置，恒温箱，加样枪（10μl-200μl，100μl-1000μl），标记笔，旋转蒸发器。 5、实验材料及试剂 大鼠6只（体重200～250g雌雄各半），啤酒花150g，乙醇（浓度分别为30%，45%，60%），无水乙醇，10%的Al(NO3)3溶液，5%NaNO2的溶液，4%的NaOH溶液， 3.8%枸缘酸钠，ADP，PH7.4的磷酸盐缓冲液。 5.1 试剂的配制 5．1．1配制浓度分别为30%，45%，60%的乙醇各400ml，10%Al(NO3)3溶液15ml，5%NaNO2的溶液15ml，4%的NaOH溶液120ml，3.8%枸缘酸钠10ml，PH7.4的磷酸盐缓冲液；之后将ADP溶于PH7.4的磷酸盐缓冲液，配制为2 umol/L的ADP溶液10ml。 5．1．2大鼠乙醚麻醉下，断颈取血，3.8%枸椽酸钠抗凝处理。1000r/min，离心5min，取富含血小板血浆（PRP）存于冰箱备用。 5.2 材料的处理 啤酒花样品去除茎叶后，充分粉碎。 6、实验操作步骤 6．1 提取条件优化方法 对影响啤酒花黄酮类化合物提取的4个因素（乙醇含量、 料液比、 提取时间、 提取温度）的 3 水平进行正交试验，筛选出一个最佳组合。 6．2 啤酒花总黄酮的提取流程 有机溶剂浸提:称取8.00 g样品，加入一定量乙醇溶剂，用加热回流装置提取一定时间后过滤，将滤液定容为100 mL。 6．3 总黄酮测定方法 从定容滤液中精密量取6mL，置于25mL烧杯中，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10 mL，摇匀，放置15分钟，之后转移到25ml的容量瓶中，再加相应浓度乙醇至刻度定容，然后加入比色杯中，以相应浓度乙醇为空白对照，按照分光光度法，在510nm波长处测定其吸光度。 6．4 实验设计 6．4．1 确定指标 即实验的结果。本实验的指标是黄酮产率。这里，用A510nm值表