免疫组织化学(荧光)方法及问题详解.pdf

目录： 1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素……………………………1 2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色……………………2 3.免疫荧光组织化学技术的荧光…………………………………….3,4 4.免疫组织化学染色结果评价…………………………………………4 5.免疫组织化学对照实验………………………………………………5 6.免疫组织化学技术应用的基本原则……………………………….5,6 7.SABC 法与其他免疫组织化学染色方法比较…………………….6,7 8.免疫组织化学技术疑难问题剖析………………………………….7,8 9.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色…………………8,9 10.非特异性荧光染色的消除…………………………………………..9 11.荧光显微镜的基本操作及注意事项……………………………..9,10 12.补体法免疫荧光组织化学染色步骤……………………………11,12 13.双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤…………………………11 14.间接法免疫荧光组织化学染色步骤………………………………12 15.双重免疫荧光标记法………………………………………………13 16.免疫荧光组织化学直接法………………………………………...13 17.免疫荧光组织化学间接法………………………………………...14 1 1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC) 、四甲基 异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate ，TRITC)、四乙基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200， RB200) 、得克萨斯红(Texas red)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE) 、花青类(cyanine，如Cy3 、Cy5)等。此外 还有一些新型荧光染料，如量子点。 (1)异硫氰酸荧光素(FITC) ：FITC 性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋 白质最常用的荧光探针。它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色。缺点是在光照下易淬 灭，易受自发荧光影响。最大激发光波长为490nm ；最大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。 (2) 四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC) ：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC 稳定性好，在生理条件 下对pH 值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。最大激发光波长为550nm；最大发射光波长为 620nm，呈橙红色荧光，与FITC 发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。 (3) 四乙基罗丹明(RB200) ：能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期 保存，广泛应用于双标记示踪染色。最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm，呈橙红色 荧光。 (4)花青类染料：常用的有Cy3 、Cy5 等，能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素 类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH 等环境不敏感。常用于多重染色。Cy3 最 大激发光波长为570nm，最大发射光波长为650nm，呈绿色荧光。但是，在绿光光谱波长激发下，Cy3 也 可出现红色荧光。Cy5 的最大激发光波长为649nm，最大发射光波长为680nm，呈红色荧光。由于Cy5 的 最大发射波长为680nm，很难用裸眼观察，而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源，因此，使用普通 荧光显微镜时，不推荐使用Cy5 。通常观察Cy5 时需使用激光扫描共聚焦显微镜。 (5)乙酸甲酯：其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲 酯。其激发光谱有pH 依赖性，是使用最多的细胞内pH 荧光指示剂。最大激发光波长为505nm，最大发 射光波长为530nm，呈绿色荧光。 (6)Indo-1：是典型的双发射荧光探针。无钙时在485nm 左右有发射峰，结合钙后，则在405nm 处有发 射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙 浓度，因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。最大激发光波长为330/346nm，最大发射光 波长为405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)荧光。 (7) 量子点(q