归去来系列CAT#70606-30常温运输，4℃保存一站式miRNA尿素.doc

归去来系列 CAT#:70606-30 常温运输℃保存 一站式 miRNA尿素电泳套装 使用手册V1.0 北京天恩泽基因科技有限公司 北京市海淀区学院南路12号北师大留学生创业园57号楼301室 QQ:944823743，449730601（销售），948393554（技术）， 电话： 010010销售）技术），order@ 产品及特点 尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea PAGE）是目前分离200 nt以下的小片段RNA，尤其是20 nt左右的microRNA（miRNA）分子的主要方法，但是单独配制各种溶液十分繁琐，为此天恩泽开发了本产品。它具有下列特点: 一站式，含有电泳所需要的所有试剂，即开即用，十分方便，免去了实验人员称取有毒物品。 灵活，可以根据需要配制各种浓度的Urea，以便对长度各异的RNA进行电泳。 电泳后可直接用于UV观察、银染、胶回收、Northern杂交和放射自显影等。 使用新型缓冲液，可以防止甘油的干扰。 规格及成分 成份 30次包装（CAT#:70606-30） 尿素 210 g 40% Acrylamide/Bis（19:1）溶液 200 mL 电泳液, 10X 250 mL TEMED 1 mL 过硫酸铵 1 g miRNAON， 10mL miRNA Marker 30次 固相RNase清除剂，100 mL 1套 使用手册 1份 运输及保存 常温运输，尿素、10X电泳液、过硫酸铵、固相RNase清除剂可以室温保存；40% Acrylamide/Bis（19:1）溶液需要4℃保存；TEMED、miRNAON、miRNA Marker需要-20℃保存。 自备试剂 miRNA样品、超纯水。 使用方法 一、准备工作 用固相RNase清除剂清洁工作的台面和器皿、制备无RNase水（详见该产品的使用手册）。 配制1 X电泳缓冲液 将适量的10X电泳缓冲液稀释10倍，得到1X电泳缓冲液待用。 配制10%过硫酸铵溶液 精确称取约100 mg过硫酸铵到一干净的1.5 mL离心管中，按1 mg过硫酸铵加10 μL水的比例加入RNase-free水，摇晃致溶，立即使用。注意：放置时间不要超过一周。 二、配制凝胶 估计所需要的凝胶溶液的体积，一般配制一块13 cm X 15 cm X 0.8 mm的胶需要15 mL凝胶溶液，配制一块36 cm X 45 cm X 0.8 mm的胶需要120 mL凝胶溶液。 根据所需要的凝胶溶液的体积，在一的干净的三角瓶中按下表加入各成分（此处以配制100mL浓度为15%的凝胶为例）: 成 份 终浓度 用量 尿素 7 M 42 g 40% Acrylamide/Bis溶液 15% 37.5 mL 10 X电泳缓冲液 1X 10 mL 补水到100mL 注: Acrylamide/Bis的终浓度需要根据待分离RNA长度选择（见下表）。 需分离的RNA长度范围 Acrylamide/Bis工作浓度 6-100 nt 20% 25-150 nt 15% 40-200 nt 12% 60-400 nt 8% 80-500 nt 5% 1000-2000 nt 3.5% 搅拌并加热到40-50℃左右，直到尿素完全溶解。 冷却到室温后，将三角瓶接上真空系统抽真空处理10-15分钟以充分去除溶液中的氧气（可以降低聚合反应效率）。但如果实验条件有限，此步也可以省略。 边摇晃溶液变加入50 μL TEMED和500 μL 10%过硫酸铵。注意：即使选择其他工作浓度的Acrylamide/Bis，TEMED和10%过硫酸铵的用量也不需要随之改变。但如果配置的凝胶溶液的体积变化，TEMED和10%过硫酸铵的用量也要按比例改变。 再充分摇晃约30秒后迅速灌胶，然后插入样品梳。 室温放置30-60分钟使胶凝固。 将凝胶板放置在电泳装置上后，在上下层分别加入适当量的1X电泳缓冲液。如果不马上使用，需要有湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。 拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液，充分将每个加样空中未聚合的Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。 三、电泳 在上样前，预电泳20-30分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样空，同时还可以使凝胶的温度升高（到50℃左右），有利于RNA电泳时维持在变性状态。预电泳电流见下面第5条。 将miRNA样品与等体积的miRNAon混合，70℃保温2-3分钟后迅速放置在冰上冷却，快速离心半分钟，放冰上待用。 关电泳仪后开始上样。注意：每次上样后如果不更换枪头，则需要充分吹打洗净枪头以防样品的交叉污染。 同时上样miRNA Marker. 重开电泳仪，对13 cm X15 cm的胶，