现代基因工程_01基因克隆和DNA分析.ppt

1. 2. 3. 蓝白斑 筛选 附： M13-纤维状噬菌体 M13是纤维状噬菌体的代表，在结构上与λ噬菌体有很大不同。 M13 DNA分子： 比λ噬菌体小得多，仅6 407bp 通常为环状双链，特殊为环状单链 M13 DNA分子相对较小的长度意味着它供外源DNA插入的空间要比λ基因组小得多。 可能原因： 1. M13的衣壳仅由3种不同蛋白的多拷贝组装而成(仅需3个基因); λ噬菌体头尾结构包含15种不同蛋白。 2. M13侵染周期相对λ简单一些，不需要将基因插入到宿主基因组中。 M13 DNA分子经纤毛注入大肠杆菌。 一旦细胞内新的单链DNA分子开始作为模板生成一条互补链时，就能够形成正常的双链DNA[图2-11(a)]。 这个双链分子不会插入细菌基因组，但会持续复制直到细胞中的拷贝数超过100[图2-11(b)]。 当细菌分裂时每个子细胞都得到一个或多个噬菌体基因组的拷贝，这些拷贝也能够继续复制，以保证每个细胞中的总拷贝数。 如图2-11(c)，新噬菌体颗粒持续组装和释放，每一个被侵染细胞在经过一代复制后都能够产生1 000个新的噬菌体。 M13作为克隆载体的吸引力 1. 基因组小于10kb： 对一个载体来说恰好处于令人满意的范围。 2. M13基因组的复制型： 非常像质粒，实验时也能够像质粒一样被处理。 3. M13基因组容易从大肠杆菌培养中获得，也能够通过转染而重新引入。 4. 最重要的是，以M13为载体克隆基因，能够得到单链形式的DNA。 单链形式的克隆基因在一些技术中能够发挥作用，尤其是DNA测序和体外突变。 使用M13载体是一种获得单链，并进行这些工作的简单而有效的方法。 病毒在其他生物体中作为克隆载体的应用 人们对病毒被用作克隆载体表现极大兴趣。 在作为克隆载体应用于动物细胞的时候，病毒有着显著的潜在能力。 哺乳动物病毒，如猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(adenoviruses)、逆转录病毒(retroviruses)和昆虫中的杆状病毒(baculoviruses)，都是一些迄今为止得到了最多关注的病毒。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIU Department of chemistry and environment engineering, University 基因工程第一讲基因克隆和DNA分析 Gene Cloning and DNA Analysis 讲课提纲 1.1 遗传学的早期发展 1.2 基因克隆和聚合酶链反应的出现 1.3 什么是基因克隆 1.4 什么是PCR 1.5 为什么基因克隆和PCR如此重要 1.6 基因重组与基因操作 1.1 遗传学的早期发展 遗传学(genetics)的诞生： 19世纪Mendel法则被重新发现； 此后，理解并掌握基因结构和功能成为方向 W. Sutton首先于1903年提出： 基因定位于染色体上的假设； T．H．Morgan于1910年实验证实该假设； 随后，Morgan和他的同事们开发出了基因制图技术； 并于1922年通过这一技术取得了对果蝇全部4条染色体上的2,000多个基因相对位置的全面分析 直到20世纪40年代，人们仍然没有认识到基因的分子本质。人们普遍认为基因是由蛋白质构成的。 遗传学的第二个高峰：1952—1966年 DNA的结构被精确地表述， 遗传密码被破解， 转录和翻译的过程也得到了描述。 经过一段时间的活跃发展之后，遗传学迎来了一个平静的发展时期。 实际上，在当时20世纪60年代的后几年，实验技术的精确性不足以满足对基因的更加细致的研究，这成为了当时遗传学发展的最大“瓶颈”。 1.2 基因克隆和聚合酶链反应(PCR)的出现 1971—1973年： 遗传学又重新开始了新一轮的迅猛发展， 归功于当时实验生物学上的革命性进展。 一整套全新的实验技术方法论被提了出来， 使原来不可能进行的实验可以被设计和实施， 尽管很难，但至少可以获得成功。 这些新方法被称为： 重组DNA技术(recombinant DNA technology) 基因工程(genetic engineering) 核心是：基因克隆 基因工程发展出—DNA测序技术： 使个体基因的结构确定成为可能 基因工程发展出个体基因调控的方法 了解到基因调控的失常将有可能导致一系列的 人体疾病，如癌症。 由重组DNA技术衍生出了生物工程学(b