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DNA合成原理
寡 聚 核 苷 酸 背景介绍 寡核苷酸的化学结构 寡核苷酸的用途 寡核苷酸的化学合成原理 寡核苷酸的纯化方法 DNA的化学结构 双连螺旋结构 1953年,沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构,开启了分子生物学时代,使遗传的研究深入到分子层次,“生命之谜”被打开,人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径 核 酸 A (腺嘌呤)、G (鸟嘌呤)、C (胞嘧啶)、 U (尿嘧啶)、T (胸腺嘧啶) 核苷酸 脱氧核苷酸 核 苷 磷 酸 戊糖:核糖 碱基:A 、G 、C 、U 脱氧核 苷 磷 酸 戊糖:脱氧核糖 碱基:A 、G 、C 、T Base=A, G, C, T Base=A, G, C, U 脱氧核苷酸 核苷酸 T 胸腺嘧啶 Thymine A 腺嘌呤 Adenine G 鸟嘌呤 Guanine U 尿嘧啶 Uracil C 胞嘧啶 Cytosine G 鸟嘌呤 C 胞嘧啶 T 胸腺嘧啶 A 腺嘌呤 寡聚核酸的用途 PCR扩增 DNA测序 亚克隆,点突变 基因建构(全基因合成) 反义核酸?? 多聚酶链式反应PCR:Polymerase Chain Reaction PCR是由美国科学家穆利斯(Kary Mullis)提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法,此技术获得1993年诺贝尔化学奖。 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。 基本反应步骤 :高温变性 → 低温退火 → 适温延伸。 寡核苷酸的化学合成原理 目前,oligo DNA的合成一般都采用固相亚磷酰胺三酯法,亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上,经过四步循环反应:脱保护、耦连、加帽、氧化,逐一将一个一个核苷酸单体连接上去,最终完成DNA链的合成。此法具有高效、快速偶联、起始反应物比较稳定的优点。 该方法的特点: ? 第一个核苷酸是3’固定在固相载体上 ? 每一个核苷酸依次连接上去 ? DNA合成的方向是3’→5’ ? 合成是在疏水环境中进行 dA-phosphoramidite dT-phosphoramidite dG-phosphoramidite dC-phosphoramidite 1. 脱DMT (Detritylation) CPG:Controlled pore glass,可控微孔玻璃珠,作为寡居核苷酸依附的 固体载体。 2. 耦连 (Coupling) 活化 (Activation) b. 耦连 (Coupling) 3. 加帽 (Capping) 耦连中未反应核苷酸链 已加帽核苷酸链 4. 氧化 (oxidation) 核苷酸的纯化方法 在所有合成循环结束后,就得到一个目标DNA片段粗品,首先需经过氨解步骤,然后再通过各种方式进行纯化。 氨 解 切 割:将合成好的寡聚核苷酸从固体载体(CPG)上化学切割下来。 常用新鲜的浓氨水来裂解CPG 上连接化合物与初始核苷间的 酯键。 脱保护基:将合成好的寡聚核苷酸上的各个碱基与磷酸上的保护基脱掉。 一般用新鲜的浓氨水来处理较长时间以脱掉氰乙基(P)、苯 甲酰基( dA、dC)、异丁酰基 (dG)。 纯 化 C18柱脱盐纯化 OPC 纯化 PAGE 纯化 HPLC 纯化 C18柱脱盐纯化 C18柱上一种活性炭柱子,又称为简易反相柱,它对DNA 有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱, 所以能有效地去除盐分。 优点:所有纯化方法中最简单的一种。 缺点:不能有效去除比目的片段短的小片段,前提是合成 效果很好时才能选用此法。 OPC 纯化 利用OPC柱中装有对DMT基团具有特殊亲和力的树脂, 合成DNA片段时保留5’端最后一个碱基上的DMT,所有合 成产物吸附在OPC柱上以后,用稀的有机溶剂洗柱,带有
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