微生物学实验-1口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色分解.ppt

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微 生 物 学 实 验 微生物学实验应当掌握 1、微生物的观察方法(制片、染色、油镜的使用) 2、微生物的培养方法(培养基配制、分装、包扎、灭菌) 3、无菌操作技术(火焰灭菌、倒平板、划线、涂平板、接种) 本课程的成绩考核: 基础实验:60% 由单个实验的成绩相加组成。每次实验由实验指导老师根据出勤、实验操作、实验报告等进行评定,具体比例为:实验出勤及实验态度占20%;实际操作30%;实技能考核30%;实验报告占20%。 自主设计实验:40% 设计实验方案 实验操作 总结 实验一 细菌的革兰氏染色 实验目的 1. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 2. 学习并掌握革兰氏染色技术,进一步熟练光学显微镜油镜的使用技术。 革兰氏染色机理 G+细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密,故在用乙醇洗脱时,肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩,因不含脂类,故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙,因此,结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞内,使其呈现紫色。 G-细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散,故遇乙醇后,肽聚糖网孔不易收缩,加上它的类脂含量高,所以当乙醇把类脂溶解后,在细胞壁上就会出现较大的缝隙,结晶紫与碘的复合物极易被溶出细胞壁,因此,通过乙醇脱色后,细胞又呈无色。这时再经番红复染,就使G-细菌染成红色,而G+细菌仍呈紫色。 实验材料 菌种 大肠杆菌 (Escherichia coli) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 试剂: 蒸馏水; 草酸铵结晶紫染液 ;卢戈氏碘液 95%乙醇; 番红复染液;香柏油;二甲苯 光学显微镜 显微镜油镜的使用与保护 插上电源插头,打开显微镜电源开关。 调节显微镜光源。 先用低倍镜、高倍镜查找标本视野,下降载物台约2cm ,加香柏油一滴于标本的待检部位,换用油镜观察。 换用油镜后,眼睛从侧面注视油镜头,缓慢上升载物台至油圈不再扩大为止,此时镜头几乎与装片接触,但不可压及装片。 观察标本时,双眼同时挣开,左眼观察,右眼画图。 油镜用毕,转动粗调将载物台下降,取下标本,用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦净,然后再用擦镜纸擦去二甲苯。 7. 使各部分还原,物镜镜头呈八字形,光源强度调至最暗,关闭电源,罩上防尘罩,收拾干净台面。 实验结果 注意事项 1. 涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性;自然干燥后再进行火焰固定(以玻片不烫手为宜)。 2.染色过程中勿使染色液干涸。 3.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节,脱色不足阴性菌被误染成阳性菌;脱色过度,会使阳性菌被误染成阴性菌。 4. 选用培养18~24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使会使革兰氏阳性菌转成阴性反应。 思考题 1.通过本实验你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?其中最关键的环节是什么? 实验二 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用 实验目的 学习并初步掌握细菌的单染色法。 了解口腔内微生物的种类。 掌握油镜的使用方法。 实验材料 试剂: 蒸馏水; 石碳酸复红染液;香柏油; 二甲苯 光学显微镜、灭菌牙签、载玻片 实验结果 注意事项 1. 载玻片要洁净无脂,否则菌液涂不开。 2. 取样时只需轻刮牙齿表面,肉眼可见少许牙垢即可,滴水不宜过多,以免干燥时间过长;涂片不宜过厚,以免水洗不完全造成背景杂乱。 3. 自然干燥后再进行火焰固定(以玻片不烫手为宜)。 4. 染色过程中勿使染色液干涸。 思考题 1.油镜观察时为何要使用香柏油?油镜的放大原理是什么?为何要等载玻片上的水分完全干燥后才进行油镜观察? 2.谈谈本次实验过后,你对口腔中微生物的认识。 实验报告 口腔中的微生物 10×100 * 实验目的 实验原理 实验材料 实验方法 实验结果 注意事项 实验报告 思考题 微生物学实验-1 革兰氏染色法(Gram staining)是微生物学中常用的一种染色方法,该染色法由丹麦医生(Christian Gram)于1884年创立,故名。 实验原理 G+细菌 G-细菌 结晶紫初染 全部细胞紫色 碘液媒染 全部细胞紫色 乙醇脱色 G- 菌无色 G+ 菌紫色 番红复染 G- 菌红色 G+ 菌紫色 革兰氏染色各步骤时细菌的外观 结晶紫初染 碘液媒染 乙醇脱色 番红复染 结晶紫 碘液 乙醇 番红 革兰氏染色操作步骤 水洗 干燥 镜检(油镜) 涂片 滴水 取菌

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