蛋白质分离纯化的一般程序.doc

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品 纯化方案是由几种纯化方法组成的 ，一般选择的依据是从抽提液中有效成分和杂质之间理化性质考虑的。如沉淀法是从溶解度的差异考虑的；离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析分别从电荷、分子量、对配体亲和力的差异性考虑的。为纯化某一有效成分，可选出由两种或更多种方法组成的方案。一般先选粗放、快速、有利缩小样品体积和后工序处理的方法；精确、费时、需样品 量少的方法后选。在每一纯化方案中，切忌一种方法重复使用。 你好!我也是位毕业的学生.希望能给你提供参考.以下是离子交换层析常见问题分析,希望能解决你的问题 1.纯化的蛋白质产率低 可能原因及解决方法： 树脂上的蛋白质未洗净，可采用增强溶液离子强度，更换活性高的反荷离子或使用去垢剂等办法解决； PH值不合适，若缓冲体系的PH值与目的蛋白的PI相差太远，目的蛋白与树脂的结合会过于牢固； 蛋白质发生沉淀，可能是因为缓冲体系PH值过于接近蛋白质PI值，溶液离子强度过低或溶液过渡稀释 ； 蛋白质在初步过滤的时候有损失； 蛋白质或者辅助因子在层析时有损失； 蛋白质水解酶破坏了目的蛋白； 树脂中有 纯化时蛋白质失活 可能原因及解决办法： 某个辅助因子或一部分蛋白质有损失，混合部分收集液，测定活性； 蛋白质在现有层析液中不稳定； 树脂中有微生物。 微生物。 3. 蛋白质不与树脂结合 可能原因及解决方法： 初上样缓冲液离子强度过大，降低初始上样缓冲液离子强度； 树脂PH值因解析作用而发生变化，注意蛋白质等电点的计算值往往与实验值差别很大； 树脂未进行适当平衡； 再生的树脂未洗净。 4. 纯化的蛋白质产率低 可能原因及解决方法： 树脂上的蛋白质未洗净，可采用增强溶液离子强度，更换活性高的反荷离子或使用去垢剂等办法解决； PH值不合适，若缓冲体系的PH值与目的蛋白的PI相差太远，目的蛋白与树脂的结合会过于牢固； 蛋白质发生沉淀，可能是因为缓冲体系PH值过于接近蛋白质PI值，溶液离子强度过低或溶液过渡稀释 ； 蛋白质在初步过滤的时候有损失； 蛋白质或者辅助因子在层析时有损失； 蛋白质水解酶破坏了目的蛋白； 树脂中有微生物。 5. 蛋白质分辨效果差 可能原因及解决办法： 层析时流速太快； 层析柱过短； 上柱蛋白过多； 梯度洗脱时洗脱液浓度变化太快； 蛋白质可在脱离