FCM技术.doc

流式细胞分析（FCM）技术 概述 ????一、概述????流式细胞分析（FCM）技术是诊断病理学的一项重要辅助诊断技术，一般用于组织病理学初步诊断后的进一步分析，应用日益广泛。????1．流式细胞分析技术主要用于肿瘤细胞的①免疫表型分析；②DNA含量分析；③非二倍体细胞定量分析；④细胞增殖活性分析等。????2．制备合格的检测样本是流式细胞分析技术的关键。????3．对样本进行荧光染色或免疫荧光染色流式细胞分析技术检测时，必须同时设立同型抗体对照、阳性对照和自发荧光对照。????4．流式细胞分析技术在淋巴造血组织肿瘤等的病理学诊断中正在成为评估预后和指导治疗的指标，有时可作为独立的病理学诊断报告项目。????5．流式细胞分析报告的内容为由流式细胞仪打印的原始检测结果。作为病理学诊断报告书组成部分的流式细胞分析报告须经有关病理医师审核后签发，必要时可由病理医师对检测结果作出评论。 ????二、单细胞悬液的制备????（一）新鲜实体瘤单细胞悬液的制备????1．酶消化法????（1）选取的组织立即放入预冷的组织培养液或生理盐水中，清洗血迹及其他污染物。????（2）解剖显微镜下弃除组织块中的坏死成分、纤维、脂肪以及血管等。????（3）用弯剪将组织块剪成约1.0mm3左右的小块，放在冷组织培养液或生理盐水中。????（4）用冷培养液或生理盐水漂洗剪碎的组织块，洗去被剪碎的细胞碎片。????（5）取约1.0g组织加入适宜的酶消化液。????（6）在37℃的恒温水浴中消化20～30min，消化期间要间断振荡或吹打。????（7）用冷培养液或生理盐水终止消化，收集单细胞悬液。????（8）先后用200目的筛网和350目的尼龙网过滤除去凝聚的细胞团块，收集细胞并计数，总量不少于106个。根据检测目的作进一步测试。如做DNA含量分析，须将细胞悬液用70%冰冷乙醇固定，置4℃冰箱保存；如做免疫荧光分析，则不必用乙醇固定。 ????2．机械法????（1）剪碎法????①将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水或0.01mol/L（pH7.4）的PBS液；????②用剪刀将组织剪至匀浆状；????③加入0.01mol/LPBS10ml；????④用吸管吸取组织匀浆，先以200目的筛网过滤至试管内；????⑤离心沉淀（1500r/min，3～5min），再用PBS洗3次，每次离心（500～800r/min）5～8min，除去细胞碎片；????⑥以350目的尼龙网过滤，除去凝聚的细胞团块。 ????（2）网搓法。????①将100目的尼龙网扎在小烧杯上（为减少污染，可将小烧杯固定在试管架上）；????②将剪碎的组织放在网上，以眼科镊子或刮刀轻搓组织块，边搓边以盐水冲洗，直至将组织搓完；????③收集细胞悬液：500～800r/min离心沉淀5～8min，然后倾弃细胞碎片，做细胞计数（应不少于106个）。 ????（3）研磨法????①先将组织剪碎至小块；????②将组织块放入组织研磨器中，加入1～2ml生理盐水；????③转动研棒，制备匀浆；????④加入生理盐水10～20ml，冲洗研磨器，收集细胞悬液，并经350目尼龙网过滤，离心（500～800r/min）沉淀5～8min。 ????3．化学法（EDTA螯合法）????（1）将组织切成小块放入试管中。????（2）先加入EDTA液5ml，室温下30min，然后弃去EDTA液。????（3）再加入EDTA胰酶5～10ml，在37℃恒温水浴中作用30min，其间间断振荡3～5次。????（4）用350目尼龙网过滤，离心沉淀（1000r/min）5min；再以生理盐水洗2～3次，离心（800r/min）5～8min。????（5）收集细胞悬液再离心1次，然后弃去上清液，将管底的细胞吹打均匀后吸入细颈吸管内，总体积约0.1～0.2ml；将其用力吹入70%的预冷乙醇中并不断振荡，避免细胞结成团块。在样本固定后置4℃冰箱中待检。????上述的酶消化法、机械法和化学法可单一选用或联用。 ????4．低渗液处理法????（1）选取新鲜肿瘤组织0.5g，剪成1.0mm左右的组织块，置于10ml试管中。????（2）加入Tris缓冲液5ml，离心洗涤1次。????（3）加入染液去污剂溶液5～10ml，置于4℃冰箱中12～24h。????（4）用350目的尼龙网过滤去除细胞团块及组织块，离心（1500r/min）沉淀5～8min，获得细胞核悬液。????（5）用标准染液进行DNA染色，上机检测。????（6）如保存样本，须将其固定于70%乙醇，然后置于4