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实验四 超氧化物歧化酶测定
高级植物生理实验报告
植物抗性生理
农学院
农药学
东保柱2013202054
2013年12月27日
实验1 超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛含量的测定
(操作步骤)
1 试剂配制
1.1 磷酸缓冲液 (PBS) 配制
药品名称 称 量
( g ) 母 液 取母液量
( ml ) 配 成 磷 酸 缓 冲 液 (PBS) ml mol/L 合并配成 稀释1倍 NaH2PO4 1.20 100 0.1 85 1000 ml
0.10 mol/L
pH 7.8 2000 ml
0.05 mol/L
pH 7.8 Na2HPO4 14.20 1000 0.1 915 注:配成PBS2000ml,其中1000ml用于A液配制,另1000ml用于酶液制备。
1.2 其它溶液配制
代
号 溶液名称 配制浓度 称取药品量( g ) 稀释或定容 配成量/每样品用量(ml/ml) 用于 A 蛋氨酸 (Met)
缓冲液 15 mmol/L Met
2.2383 加1000ml pH7.8, 0.1mol/LPBS 1000 / 2 SOD活性测定 B 乙二胺四乙酸
(EDTA) 溶液 0.003
mmol/L EDTA
0.0877 (1)100ml 热蒸馏水
(2) 再稀释1000倍 1000 / 0.1 SOD活性测定 C 核黄素(VB2)
溶液 0.1 mmol/L VB2
0.0038 100 ml 蒸馏水 100 / 0.1 SOD活性测定 D 蓝四氮唑
(NBT)溶液 0.1 mmol/L NBT
0.0818 1000 ml 蒸馏水 1000 / 2 SOD活性测定 E 三氯乙酸
(TCA) 溶液 10 % TCA
100 1000 ml 蒸馏水 1000 (用于液的配制) 丙二醛(MDA)含量测定 F 硫代巴比妥酸
(TBA)溶液 0.5 % TBA
5 1000ml 10%的
液 1000 / 2 丙二醛(MDA)含量测定 2
称取植物材料1g,加少许0.05mol/L、pH7.8的磷酸缓冲液在冰浴中研磨,最终定容制得10 ml匀浆。转移至10ml离心试管中,在3000 rpm下粗离心1分钟,粗提液再转移至2个5ml离心管中,在冷冻离心机13000g、4℃下离心20分钟,上清液即为酶液,用于SOD活性和丙二醛含量的测定。
3 丙二醛含量测定
吸取酶液2ml→加入F液2ml→沸水浴加热15分钟(呈粉红色)→快速冷却→4000rpm 下离心5分钟。若以种子为材料,则加热后溶液混浊,需增加离心力。以F液为参比液,分别在532nm 和600nm处测定光密度值。
丙二醛含量(nmol·g-1)=
式中:V/v --- 提取液总量(10ml)/测定液用量(2ml)
R --- 反应液总量(4ml)
W --- 植物材料鲜重或干重(g)
0.155 --- 丙二醛的摩尔浓度消光系数(当[MDA]=1nmol/ml时,OD532-OD600=0.155)
[即( OD532—OD600) / 0.155的单位为1nmolMDA / ml ]
室温下处理的叶片在523nm出的光密度值
次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 OD523 -0.006 -0.007 -0.011 -0.012 -0.003 0.023 0.025 -0.016 -0.003 0.012 -0.0022
室温下处理的叶片在600nm出的光密度值
次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 OD600 -0.027 -0.054 -0.054 -0.027 -0.042 -0.027 -0.043 -0.042 -0.042 -0.027 -0.039
室温下丙二醛含量(nmol·g-1)=
=-0.0022+0.039/0.155×4×10/2×1=4.75 nmol·g-1
冷处理下的叶片在523nm出的光密度值
次数 1 2 3 4 5 6 7 平均值 OD523 0.078 0.077 0.077 0.076 0.078 0.076 0.076 0.077
室温下处理的叶片在600nm出的光密度值
次数 1 2 3 4 5 6 7 平均值 OD600 0.025 0.026 0.026 0.027 0.027 0.026 0.026 0.026
冷处理下丙二醛含量(nmol·g-1)=
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