国内鸡传染性支气管炎病毒分子流行病学调查.doc

国内鸡传染性支气管炎病毒分子流行病学调查 ～鸡传染性支气管炎病毒；QX；S1基因；序列测定；同源性比对鸡传染性支气管炎是由冠状病毒科的鸡传染性支气管病毒（IBV）引起的鸡的一种传染病。根据其临床表现的侧重点不同，可将本病分为呼吸型、生殖型、肾型和致腺胃病变型等多种类型。IBV的基因组核酸在复制过程中易发生突变和高频重组，不同毒株的生物学特性、致病性和组织嗜性复杂多变，根据其免疫原性的差异可将IBV分为众多的血清型，不同血清型IBV之间交叉保护性相对较差，从而给疾病诊断和防治工作带来极大困难。现有的商品化疫苗不能对现流行毒株提供有效的保护作用，导致IB在我国免疫鸡群中持续流行和传播。因此，研制新的IBV弱毒疫苗对于预防和控制我国IB的发生和流行具有重要意义。IBV主要含有3种结构蛋白，即纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）和核蛋白（N），其中S蛋白可进一步裂解为S1蛋白和S2蛋白。S1蛋白与IBV的免疫原性关系最为密切，可诱发血凝抑制抗体和病毒中和抗体，血清型特异性抗体也是主要针对S1蛋白[2]，所以S1基因是IBV的主要免疫原基因。另外IBV基因组中的高变区主要集中S1部位[3]，研究其序列有利于从分子水平上揭示IBV的变异基础和规律，对使用疫苗预防IB具有重要的指导作用，对开发相应的基因工程疫苗有重要意义。研究拟对2009～2013年间国内IB的流行现状进行全面流行病学调查，以系统评估QX型IBV在国内的最新流行情况，为针对该基因型新型疫苗的研制提供依据。 1 材料 1.1 SPF种蛋 购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。 1.2 菌种和质粒 基因工程菌Trans1-T1感受态细胞及克隆载体pEasy-Blunt Vector购自北京全式金生物技术有限公司。 1.3 酶类和主要试剂 反转录酶（M-MLV）购自大连宝生物工程有限公司。Phusion?超保真DNA聚合酶购自美国New England Biolabs公司。RNA提取试剂盒、PCR 产物凝胶回收试剂盒均为天根生化科技（北京）有限公司产品。 2 流行病学调查及方法 2.病料采集 由扬州大学农业部禽用生物制剂创制重点实验室、中国动物卫生与流行病学中心、青岛易邦生物工程有限公司北京信偌晶合生物科技有限公司于2009～2013年之间从江苏、福建、山东、河南、北京、河北、辽宁、吉林、黑龙江、新疆、青海、天津等多个省（直辖市、自治区）多个疑似发传染性支气管炎的鸡场采集。样品包括发病鸡的气管、肺、肾、盲肠扁桃体等。 2.2 病毒分离与鉴定 将无菌采集的样品用灭菌生理盐水匀浆制成20%悬液，3000 r/min离心15 min，取上清除菌后经尿囊腔途径分别接种10日龄SPF鸡胚，孵化144小时，收集尿囊液并进行HA测定，同时观察鸡胚的变化。一般每份样品需要连续盲传3-5代，对出现鸡传染性支气管炎典型病变的鸡胚收获尿囊液进行进一步鉴定。 2.3分离株S1基因测序与遗传进化分析 2.3.1引物设计 从GenBank获取多条IBV S1基因的核苷酸序列，比对后针对保守区设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下所示: 上游引物S1-F: 5′-ATGTTGGGGAAGTCACTGTTTTTAG-3′ 下游引物S1-R: 5′-TGCGACGATGTGAGCTATTGG-3′ 2.3.2病毒RNA的提取 取分离株含毒鸡胚尿囊液，按照天根生化科技（北京）有限公司RNA提取试剂盒产品说明书提取病毒RNA。 2.3.3 反转录 按以下体系进行反转录，制备cDNA： DEPC水9.5μl，dNTP 4μl，5×M-MLV Buffer 4μl，M-MLV反转录酶（200U/μl）1μl，6nt随机引物1μl，RNase抑制剂0.5μl。 程序：25℃10min；42℃ 60min；70℃10min。 2.3.4 RT-PCR 扩增 按以下体系进行： 去离子水 13.75μl，dNTP 2μl，5×Buffer 5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，Phusion?超保真DNA聚合酶 0.25μl，cDNA 2μl。 程序：98℃ 30s；25cycles：98℃ 7s，60℃ 25s，72℃ 100s；72℃ 7min；4℃，forever。 2.3.5 电泳：1%琼脂糖凝胶电泳，120V，35min。 2.3.6 PCR产物凝胶回收：按照天根生化科技（北京）有限公司的PCR 产物凝胶回收试剂盒说明书进行。 2.3.7 S1 基因克隆与测序 将回收的PCR产物4μl与pEasy-Blunt 载体1μl进行连接，25℃ 连接15min，再将连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，在含有X-Gal、IPTG和Amp的LB琼脂平板培养基上37