大肠菌群计数案例.ppt

大肠菌群计数 严纪文 大肠菌群的定义 指一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 该菌群主要来源于人畜粪便, 作为粪便污染指标评价食品的卫生状况, 推断食品中肠道致病菌污染的可能。 大肠菌群不是细菌学上分类命名，而是一组与粪便污染有关的细菌。这群细菌包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌。 生化特征及血清学反应并非完全一致。 分布： 广泛分布于自然环境。 来源于人和温血动物的粪便。 卫生学意义 大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样品中是否受到粪便的污染。 大肠菌群计数的高低，直接反映了样品受粪便污染的程度。 表示对人体健康是否具有潜在的危险性。 大肠菌群是理想的粪便污染的指标菌 是人类和温血动物肠道菌群，在数量上占优势。 随粪便排出体外后，在外界环境影响下，其存活时间应与肠道致病菌大致相似或稍长。 检验方法简便，易于检出与计数。 对消毒剂的抵抗力应不低于肠道致病菌。 大肠菌群计数 第一法：MPN法 第二法：平板计数法 第三法：Petrifilm测试片法 第一法 大肠菌群检验MPN法 培养基改变情况 原标准 乳糖胆盐发酵管 EMB琼脂 乳糖发酵管 操作步骤的改变 大肠菌群检验程图(新国标MPN法) 样品的处理和稀释 固体和半固体食品：以无菌操作取25g）样品,放入装有225 mL生理盐水的无菌均质杯内,于8000 r/min均质1min～2min,制成1:10样品匀液，或放入225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。 液体食品：以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)中,以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。 根据对样品污染情况的估计,按上述操作，依次制成系列十倍系列样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时要进行调节，如有些果汁pH值很低，如果不进行调节，检验结果的误差可能就会比较大。 第一步：初发酵 选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液，液体样品可以包括未经稀释的原液，每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1mL，则用双料LST肉汤）。 36℃±1℃培养24h±2h，检查倒管内是否有气泡产生或轻摇试管时是否有密集连续的细小气泡从管底逸出，如未产气则继续培养至48h±2h。 记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性；对产气者，则进行复发酵试验。 注意：以48h±2h为最终观察结果时限。结果也以此时为最终结果。 第二步：复发酵 用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中，置36℃±1℃温箱内，培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 月桂基磺酸钠能抑制革兰氏阳性菌的生长，同时比胆盐的选择性和稳定性好。由于胆盐与酸产生沉淀，沉淀有时候会使对产气情况的观察变得有些困难； 乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠道致病菌； 胰蛋白胨提供基本的营养成分； LST肉汤是国际上通用的培养基，与乳糖胆盐肉汤的作用和意义相同，但具有更多的优越性。 发酵试验判定原则：产气为阳性。 检测步骤减少（不必分离培养），检测时间缩短24h。 注：如接种量超过1mL，则应用双料LST肉汤 胆盐可抑制革兰氏阳性菌。 煌绿是抑菌抗腐剂，可增强对革兰氏阳性菌的抑制作用。 乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠道致病菌。 发酵试验判定原则：产气为阳性。由于配方里有胆盐，胆盐遇到大肠菌群分解乳糖所产生的酸形成胆酸沉淀，培养基可由原来的绿色变为黄色，同时可看到管底通常有沉淀。 结果报告 根据大肠菌群阳性管数, 查MPN检索表，报告每 g (mL)样品中大肠菌群的MPN值。 MPN检索表的应用 MPN（最可能数）是表示样品中活菌密度的估测。因此MPN值只是活菌密度的估算值，并不是样品中活菌数的真值。 1g(mL)检样中最大可能数（MPN）表 使用MPN检索表的注意点 这个MPN检索表是ISO、FDA、AOAC、USDA/FSIS、北欧等标准通用的。 表里的数字是有小数点的。 报告单位不同。现报告单位为g/ml，而原报告单位是100g/ml。 原标准MPN表有64个组合，而现标准MPN表只有40个组合。 当实验结果在MPN表中无法查找到MPN值时，如：阳性管数为122，123，232，233等时，建