9分子生物学教程解决方案.ppt

分子生物学实验 课程编号：课程名称： 分子生物学实验技术 学分/学时：1.5/36 课程层次： 专业必修课 修读类型： 必修 考核方式： 实验报告、笔试 开课学期： 第6学期 适用专业： 生物技术专业 目 录 实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定 实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取 实验三、琼脂糖凝胶电泳 实验四、ＤＮＡ的限制性酶切 实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA的转化 实验六、PCR基因扩增技术 实验一、植物染色体DNA的提取 及纯度鉴定 一、实验目的 掌握真核植物基因组染色体DNA的一种提取方法 学习使用紫外分光光度法鉴定DNA的纯度，估计相对含量。 二、实验原理 用低温机械研磨和高浓度、SDS等破坏细胞壁及膜，使蛋白变性使DNA与蛋白分离，用一定浓度的溶液将DNA提取出来，用高浓度乙醇沉淀DNA，氯仿/异戊醇等去除杂质，RN ase降解核酸，得到纯度较高的DNA样品。根据核酸与蛋白质分别在OD260和OD280有吸收峰分别测定之，比较OD260/OD280比值在1.8附近程度估计纯度，依据经验公式计算DNA含量。 三、实验材料与试剂物品 1.材料 香椿（Toona sinensis）黄花苗 2、试剂 提取缓冲液（预冷） SSC RNase液 3、仪器设备 高速冷冻离心机（8-316） 制冰机（8-312） 紫外可见分光计（8-316） 冰箱（-86度在8-312，-20度，4度在8-312） 水浴锅 电子天平 玻璃仪器等 四、实验操作流程 采摘芽苗，洗净→剪小段，擦干表面水分→放-86度冰箱冻30分钟以上→冰浴研磨匀浆（分次加提取液）→以下见讲义 五、结果与处理 纯度 含量 思考题：影响本实验结果的因素有哪些，要得到高纯度的DNA需要在实验中注意哪些问题？ 常用的质粒载体 是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19(500~700 　　　　Ampr抗性基因 Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力 　二、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。 提纯的思路 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质： 　蛋白 　基因组DNA 　脂类及小分子杂质 　RNA 三、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含有质粒的大肠杆菌JM83+、LB液体培养基 （三）试剂： 溶液I 　　作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II 　　作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 溶液III 　　作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋　　　　　　　可中和DNA 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 　作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫） 注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液：溶解DNA 　　　　四、实验步骤 实验三、琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的　　 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 二、实验原理 DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 核酸为两性分子，在PH3.5时，整个分子带正电； PH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 　共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。 三、仪器、材料与试剂 （一）?? 仪器　 （二）材料　 1.自已提取的质粒DNA 2.相对分子质量标准品 （三）试剂　 1．5× TBE储液(PH8.0)　使用时稀释 10倍成0.5×TBE （1×TBE也可）。 2．凝胶加样缓冲液　0.2%溴酚蓝，50%蔗糖