作業耿涛家蚕真菌分子治病机理的研究进展.doc

引言 随着昆虫分子生物学技术及水平的迅速发展，家蚕病原微生物的分子生物学研究也不甘落后。家蚕病原微生物包括真菌、细菌、病毒以及一些原生生物。目前人们对家蚕病原性病毒、细菌和原生生物的感染机制和致病机制研究的比较透彻，并建立了系统的诊断、预防和治疗措施。但是，由于家蚕真菌种类繁多，生长方式特殊，遗传方式多样性等原因，人们对家蚕真菌病的研究还处于起步阶段。本文通过查阅各类文献，对昆虫病原真菌的浸染机制、致病机制、免疫机制以及基因工程的研究进展进行总结，并对家蚕病原真菌的研究进展做一综述，以期对家蚕病原真菌的研究方向和研究策略的制定提供有力的参考依据。 1昆虫真菌的侵染机制 不同于昆虫病原细菌和病毒，昆虫病原真菌通过昆虫表皮主动入侵进入寄主体内，并最终杀死昆虫，其侵染寄主的复杂过程主要可分为3个阶段：1)体表附着阶段；2)体壁穿透阶段；3)体内定殖及致死阶段。整个过程涉及寄主识别、机械破坏、营养竞争、代谢干扰、毒素分泌及寄主组织结构破坏等，这些多因子作用最终导致寄主死亡[1]。基因表达序列标签(expressed sequence tag，EST)和微列阵(Microarray)技术研究表明，金龟子绿僵菌在昆虫体壁、昆虫血淋巴和植物根分泌物诱导下，表达基因种类及水平均存在很大程度上的差异，说明不同侵染阶段虫生真菌采用完全不同的基因对策。在体壁侵染过程中，附着胞的形成和相关水解酶的作用起着非常重要的作用，而细胞壁结构的重新“组装”(re．modification)及杀虫毒素的分泌等决定了虫生真菌能否在寄主体内成功定殖和最终杀死昆虫宿主。 2昆虫真菌的致病机理 迄今为止，对昆虫病原真菌致病机制的研究主要集中在真菌穿透寄主表皮过程中产生的一些水解酶类，其中蛋白酶和几丁质酶等主要水解酶类在真菌穿透寄主表皮过程中起着十分特殊的作用[2]。虫生真菌穿透寄主昆虫体壁的一般过程为：分生孢子首先贴附于寄主体表一孢子萌发形成芽管一芽管末端分化出附着胞一附着胞长出侵染钉或侵染菌丝一入侵菌丝穿透体壁进入血淋巴。在此过程中，附着胞既是侵染结构，又可促进附着，并且可在体表寻找适当的入侵位点，附着胞通过机械力和水解酶(蛋白酶、几丁质酶等)的共同作用穿透昆虫体壁。分生孢子是否能附着在昆虫体表并萌发是整个侵染过程的关键[3]。附着胞经过一段时间的膨大并形成与感染密切相关的结构——侵人钉(infectionpegs)，病原真菌借此侵入寄主体内[4-5]。病原真菌侵入寄主体内后，首先面临的是寄主免疫系统的抵抗[6-7]。尽管昆虫的免疫系统比较原始，但它们仍能对昆虫病原菌作出强烈的免疫反应甚至可能将其消灭；而昆虫病原真菌则可能分泌出特殊物质以抑制或逃避宿主的细胞免疫反应使真菌建立感染[8-9]。一旦有致病能力的病原真菌突破寄主的防线后，就会利用寄主体内营养物质进行迅速增殖，使得寄主体内菌丝、菌丝段和芽孢不断增殖，并随着血液的循环和自身的生长集结到体内各组织周围，直至布满整个体腔和定殖于各组织器官。导致宿主昆虫营养衰竭、抵抗力降低、体液循环受阻和组织器官发生病变。同时，真菌毒素的作用以及引发的寄主生理生化上的变化如血腔的PH改变、酶活性变化、昆虫脱水等，最终导致虫体死亡[10-13]。 3虫生菌的蛋白酶纯化、基因克隆和表达调控的研究 目前所分离、纯化的酶类主要是虫生真菌入侵昆虫体壁过程中所产生的蛋白酶类，因而在不同程度上表现与菌株毒力相关。St Leger由巨大蜚蠊(Blaverus gigantesu)体壁离体诱导试验表明，金龟子绿僵菌孢子萌发过程至少有42种蛋白产生[14-15]。另外就酶活性而言，PR2、PR4、TRY1也可认为属于同一类同工酶系。几丁质酶系又可分为几丁质内切酶系(分子量为33kD、42kD、28.6kD)和外切酶系(66kD)两太类。Kang等分离的60kD几丁质酶既具内切酶活性又具外切酶活性，金龟子绿僵菌中至少存在10种不同的几丁质同工酶[16]。显而易见的是由于氨基酸序列不同，编码这些酶的基因也不尽相同，prlA 及prlB 还位于不同的染色体上[15]。新近克隆的金龟子绿僵菌胰凝乳蛋白酶只表现出与放线菌灰色链酶菌(Streptomyces griseus)类蛋白55％的同源性[17]。 4抗菌肽的研究进展 近年，国内也在昆虫抗真菌肽方面取得了一些进展[18]。Wang等从中药干蛾蝉中分离鉴定到了仅对丝状真菌有抗性的Cicadin[19]；黄亚东等克隆表达了Drosomycin系列基因，表达产物对某些真菌有较高抗性[20-21]。翁宏飚等在大肠杆菌中克隆并高效可溶性表达了Thanatin基因[22]。Yuan等在大肠杆菌中高效表达了融合基因Drosomycin，其生物活性与天然Drosomycin相同[23]。Li等利用大肠杆菌融合表达了具生物活