分子生物教材修改.doc

分子生物学实验技术 第一章 重组质粒构建实验 实验目的：构建重组质粒 实验试剂： Trizol 无RNA酶灭菌水。 75％乙醇（DEPC水配置） 氯仿 ddH2O RT试剂 PCR试剂 SOB肉汤 SOB平板 SOB平板（50(g/ml氨苄青霉素） Ampicillin 溶液Ⅰ： 50mmol/L 葡萄糖 25mmlol/L Tris·Cl(PH8.0) 10mmol/L EDTA(PH8.0) 在10 lbf/in2(6.895×104pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，贮存于4℃。 溶液Ⅱ： 0.4mol/L NaOH 2% SDS 临用前配制，1：1混合 溶液Ⅲ： 5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1） 无水乙醇、70%乙醇 BamHI 1套 HindIII 1套 1%琼脂糖凝胶（含EB） 凝胶回收试剂盒 1套 T4 DNA Ligase 1套 1Kb DNA 分子量标准 实验步骤： 目的基因的获得 RNA提取 ， RT 在冰上操作，依次加入下列试剂 总RNA 0.5μg（） μL 10 × Buffer 5μL dNTP mixture(2.5mM) 4μL 引物上(20pmol/μL) 1μL 引物下(20pmol/μL) 1μL MgCl2(25mM) 4μL 模板(102-105 拷贝) 0.5μL DNA Polymerase 0.4μL 总体积 50μL 例：如引物的GC含量50%左右，待扩增基因500bp-1kb，参数可设置为：95℃变性处理3min后进入循环， 94℃ 30S、56℃ 30S、72℃ 1min，30个循环后72℃延伸7min。同时设立对照组（1）有模板，无引物；（2）有引物，无模板。反应结束后电泳检测。 退火温度和延伸时间是各参数中的关键，其中退火温度主要根据引物的GC含量确定；而延伸时间主要根据扩增的目的基因的长度确定，一般每1kb增加1min。此外，反应体系中Mg2+的浓度也很重要。 提取克隆载体： 挑取1个菌落接种于3mL SOB肉汤（100(g/ml氨苄青霉素）中，37℃, 300rpm振荡培养过夜；取1.5mL-3.0mL菌液13000rpm,4℃离心1min，弃上清，使细菌沉淀尽可能干燥。沉淀加入冰预冷的悬浮液（溶液I）100μL，剧烈震荡混匀；加入新配置的裂解液（溶液II）200μL,倒转几次至液体变清为止；加入冰预冷的中和液（溶液III）150μL，室温下轻轻混匀，置于冰上3-5min, 13000rpm,4℃离心5min；取上清液于另一只管中，用饱和酚:氯仿:异戊醇进行抽提，13000rpm,4℃离心2min，取上清液加入2倍体积的无水乙醇，震荡混合，室温放置5min，13000rpm，4℃离心5min，弃上清，自然干燥，用30-50μL含无DNA酶的RNase(20μg /mL)的TE溶解，37℃作用30min后，50μL PCR反应体系取0.5-1μL 为模板，后-20℃保存备用。 二、双酶切载体和目的片段 双酶切载体 如酶切位点合适，可提取克隆载体，双酶切出目的片段。 例：克隆载体 5μL（1μg） 10×buffer(E) 4μL 10×BSA 4μL BamHI 1 μL HindIII 1 μL ddH2O 25 μL 37℃作用1h，取5μL进行电泳检测，其余的进行凝胶回收后直接用于连接。 双酶切目的片段 如酶切位点合适，可提取克隆载体，双酶切出目的片段。 例：目的片段 5μL（1μg） 10×buffer(E) 4μL 10×BSA 4μL BamHI 1 μL HindIII