分子生物原理基因工程.ppt

分子生物学原理 第一节、自然界的基因重组 转化：transformation 整合：integration 转导：transduction 转位：transposition 转化 转化： 由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。 转化 病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。 整合 整合： ? 噬菌体感染大肠杆菌的第一步 ? 噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的? DNA注入菌体中。 此? DNA可与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。 溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。 裂解： ? 噬菌体感染大肠杆菌的第二步 ? DNA利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新? 噬菌体，并将细菌涨破。 整合 溶原和裂解可以相互转变。 转导 溶原菌中? DNA可以原样地切离出来，也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走一部分。后者称转导。 带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。 来源于宿主的基因称转导基因。 转位 转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。 这些游动的基因称为转位子(transposon)。 第二节、基因工程 基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆。也叫基因克隆或重组DNA技术。 分子水平上操作，细胞水平上表达。 赋予重组DNA以新的生命力。 基因工程 基因克隆 载体和目的基因 载体：vector 在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分子。但必须利用宿主的酶系统，才能有进一步的基因表达能力。 常用的载体有： 质粒、 ? 噬菌体 、 M13 噬菌体 逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA 载体与宿主共培育可大量生成，经纯化后可用于基因工程。 质粒 质粒：plasmid 环形双链DNA，大小约为数千碱基对，存在于大多数细菌的胞质中。 拷贝数：每个细菌能容纳的质粒数目。 质粒的性质： 易于从一个细菌转移入另一个细菌。 有两三个抗药性基因。 有一个限制性内切酶切口。 质粒 pBR322：常用的质粒 噬菌体载体 ? 噬菌体 、 M13 噬菌体 易于感染大肠杆菌 ? 噬菌体DNA比质粒大，对限制性内切酶有不止一个切口，需经过改造。 一个切口：插入型载体。 二个切口：置换型载体。 噬菌体载体 目的基因的来源 直接从染色体DNA中分离：原核生物 人工合成：简单的多肽 从mRNA合成cDNA：真核生物 基因文库：(gene library） G文库：用基因组的全部DNA制备。 c文库： 用细胞的全部mRNA制备出全套cDNA后建库。 从mRNA合成cDNA 限制性内切酶的应用 限制性内切酶可辨认4~6个核苷酸：回文结构 回文结构：palindrome DNA双链具有方向相反顺序一致的结构。 平端：blunt end 在同一水平上切断两条链。(钝型末端) 粘性末端：sticky end 碱基序列被酶以错开几个核苷酸的形式切开。 限制性内切酶的应用 Alu I ….AGCT….. ….AG CT... 平端 …..TCGA….. ….TC GA... 限制性内切酶的应用 切载体 载体和目的基因的连接 人工连接器：linker 人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内切酶的识别序列。 DNA连接酶：可用于连接碱基互补的二段核酸链。 连接方式： 粘端连接方式 尾接法 重组体的转化 基因的转移：