常用分子生物学技术的原理及其应用选编.ppt

基因组文库和cDNA文库的构建和筛选 第一轮筛选 第二轮筛选 第三轮筛选 基因组文库筛选结果举例 cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。 二、cDNA文库 第四节 生物芯片技术 Biological Chip Technique 是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。 一、基因芯片 基因芯片(gene chip) 基因芯片工作流程示意图 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。 二、蛋白质芯片 蛋白质分子间的亲和反应 蛋白质芯片(protein chip) 蛋白质芯片作用原理 第五节 生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study 一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选 常用蛋白质相互作用的研究技术 标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。 （一）标签蛋白沉淀 标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。 标签融合蛋白沉淀实验流程示意图 （二）酵母双杂交技术的基本原理和用途 酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。 电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。 二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术 （一）电泳迁移率变动测定 放射自显影 未结合探针 结合有蛋白的探针 标记探针 1X 1X 1X 1X 核蛋白提取物 1X 10X 10X 未标记探针 10X 凝胶迁移实验结果示意图 染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。 （二）染色质免疫沉淀法 染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图 目录 目录 常用分子生物学技术的原理及应用 The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology 第九章 第一节 分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 一、分子杂交与印迹技术的原理 复性 RNA DNA （一）印迹技术 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。 用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 （二）探针技术 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹 (Southern blotting) （二）RNA印迹 (Northern blotting) （三）蛋白质的印迹 (Western blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 用于RNA的定性定量分析。 用于