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第十三章 基因转移和基因打靶 第一节 基因转移 第二节 基因打靶 基因转移 应用物理、化学方法将外源基因转移 基因转移：应用物理、化学方法将外源基因转移到受体菌或细胞，并实现其转入基因的扩增和表达。 基因打靶：通过外源基因与靶细胞染色体上同源序列间的重型组，将外源基因定点整合入靶细胞染色体上某一确定位点，或使某一基因发生定位突变的技术 。 到受体菌或细胞，并实现其转入基因的扩 增和表达。 基因打靶 通过外源基因与靶细胞染色体上同 源序列间的重组，将外源基因定点整合 到靶细胞染色体上某一确定位点，或使 某一基因发生定位突变的技术。 第一节 基因转移 一、物理学方法 二、化学方法 三、生物学方法： 一、物理学方法 1、显微注射法 2 、电穿孔法 3 、基因抢法 1、显微注射法： 用玻璃显微注射器，在外科手术显微 镜下将外源DNA直接注射入靶细胞的核内。 其受体细胞主要是体积较大的受精卵细胞， 这也是转基因动物的常用方法之一。 用贴塑培养的体细胞作为受体细胞， 注入核内的外源基因大约有25%整合到受 体细胞的染色体中，并稳定表达。 方法的熟练十分重要，用电脑控制 的微注射装置，每小时可注1500个细胞。 2、电穿孔法： 在高压电场的短暂作用下，细胞 膜上可出现可逆的孔洞，外源DNA可通 过此孔洞进入胞内。 方法适应不同细胞如细菌、酵母 植物及动物细胞。 需电穿孔仪。 方法：细胞悬浮于石英池内，将外源 DNA加入到池内的介质中，池的两边有两个 电极，接高压电源。 当给予极短的高压脉冲电场时，在细 胞膜两边产生一个高于其阀电位的膜电压 势能，使细胞膜被打碎，形成许多瞬间小 孔，允许外源DNA分子进入。 此法可将150kb的DNA分子转入灵长类 动物细胞。 该法简单，复制性好，效率高，尤其 是酵母细胞和细菌，远高于化学法，且转 染DNA的突变率也比化学法低。 适用于克隆基因的短暂或持续表达。 缺点：细胞损伤较大，不易成活。 3、基因抢法： 又称为微抛射物撞击法或颗粒加速法等 广泛地用于细菌、酵母、真菌藻类、植 物和动物细胞，甚至离体组织器官的基因 转移。特别对一些用其它方法很难或不能 转化的细胞可用此法。 该法还可使叶绿体和线粒体基因组的转 化成为可能。 方法和原理 将DNA 吸附到高粘度微小的金属 颗粒（钙或金）上，在一种加速装置 的作用下，将这些颗粒高速射入细胞 或组织中，以实现DNA 的转移。 该法虽应用的细胞范围广，但 需特殊装置，转染率的影响因素也 很多，如金属颗粒的性质、大小、 粘度、密度、冲击力大小、DNA浓 度、细胞状态等。 二、基因转移的化学方法 1、氯化钙转移法 2、金属离子转移法： 3 、DNA-磷酸钙共沉淀法 4、DEAE-右旋糖苷法 5、脂质体转染法 6、原生质体融合法 1、氯化钙转移法 CaCl 转移法对λDNA和超螺 2 旋质粒转化大肠杆菌的效率可 达105-6菌落/ μgDNA 。 常规法是： (1)离心收集对数期细菌，悬于预 冷CaCl2溶液中（原培养液1/2体 积），离心后重悬细菌(原培养液 1/5的CaCl2)。 (2)细菌悬液和一定量的待转化 质粒DNA或噬菌体DNA混合，0℃放置 30分钟，42℃热冲击90秒，快速冷 却, 加适量LB培养基，37℃使冻存 的细菌复苏，涂布到原抗生素的选 择培养基上筛选转化子。 使用不同组合的二价阳离子混合液 （Ca2+ 2+ ，Mn ）。延长CaC l 处理菌的时 2 间 或加用二甲亚砜 （DMSO）等试剂辅 助处理菌等，可提