微生物实验指导微生物验指导.doc

实验一 显微镜油镜的使用和细菌三种基本形态观察 二、基本原理 油镜是显微镜物镜中重要的镜头，其上刻有“OI”或“HI”字样，也有以刻一圈红线或白线为标记，用于区别其它物镜。油镜的使用比较特殊，需在玻片与镜头之间加滴镜油，其原理如下： 1． 增加照明强度 油镜的放大倍数可达100×，其镜头焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。需在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率n=1.52），目的是使进入物镜的光线不会由折射或反射造成损失，基本上全进入镜头，因此提高了照明强度，使图像更加清晰。不同介质的折射率是不同的，用空气作介质，折射率为（n=1）;用水作介质，折射率为（n =1.33），它们的折射率都比香柏油低，其光线通过玻片后会发生折射或全反射，不能完全进入物镜，造成光的损失，结果降低了视场亮度，使图像不清晰。由此可见，提高介质的折射率，就可提高图像的清晰度。 2． 增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离（D）的能力。D值愈小则表明分辨率愈强。D值可用如下下公式表示： 式中入=光波波长； N A=物镜的数值孔径值。 分辨率取决于物镜的数值孔径和光源波长，即显微镜分辨率与物镜的数值孔径成正比，与光波波长成反比。波长愈短，数值孔径愈大，分辨距离愈短，则分辨能力就愈强。光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（400～770nm），虽然利用紫外线作光源可提高分辨率，但应用范围有限，只适用于显微镜摄影而不适用直接观察。数值孔径则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，即指介质的折射率与镜口角1/2正弦的乘积，可表示为： 式中n=物镜与标本间介质的折射率；a=镜口角（通过标本的光线延伸到物镜前透镜边缘所形成的夹角 图1-1）。 图1-1 物镜的镜口角 影响数值孔径的因素之一是镜角口。式中a为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距。当Sin（a/2）增到最大时，a/2=90°，就是说，进入透视镜的光线与光轴成90°角，这是不可能的，所以Sin(a/2)的最大值总是小于1。现在所用的油镜其a/2为60°左右。影响数值孔径的另一因素是介质的折射率，前面已说到，不同介质的折射率是不同的，空气的折射率为1.0，水的折射率为1.33，香柏油的折射率为1.52，玻璃的折射率为1.55。因此，在物镜和玻片标本间加入香柏油作介质时，数值孔径就可以增大到1.2—1.4。人们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm，假如数值孔径NA=0.65高倍物镜，能分辨两点之间的最小距离为0.42μm，而小于0.42μm的两点之间距离就分辨不出，而使用数值孔径NA=1.25油镜，能分辨两点之间的最小距离=0.552×1.25=0.22μm。因为不论总放大倍数多大，用普通光学显微镜是无法观察到小于0.2μm的物体。但是大部分细菌直径在0.5μm左右，故用油镜就能清晰地观察到细菌的个体形态及某些结构。 显微镜的总放大率是指物镜放大率和目镜放大率的乘积。但由于物镜和目镜搭配不同，其分辨率也不同，例如，在总放大率相同情况下，采用数值孔径大的40×物镜和10×目镜相搭配，其分辨率就比数值孔径小的20×物镜和20×目镜相搭配的要高些，效果也更好。 三、实验器材 1. 标本：细菌三型玻片。 2. 试剂：香柏油、显微镜清洗液（酒精乙醚液）。 3. 器具：显微镜（有油镜）、擦镜纸等。 四、操作步骤（用油镜观察细菌） 显微镜观察时，应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。 1. 放置标本 将染色的细菌三型玻片置于镜台上。 2. 找合适的视野 先用低倍镜寻找合适的视野，并将欲观察的部位移到视野中央。 3. 转换油镜 将油镜转到工作位置。 4. 调节聚光器与油镜数值孔径一致 只要将聚光器上升到最高位置，可变光阑开到最大，此时两者的数值孔径即达到一致。 5. 加香柏油 取香柏油1-2滴加到欲观察部位涂片上，从侧面注视然后将油镜转到工作位置，下降镜筒或上升载物台，使油镜浸入香柏油中。必须十分注意，油镜头不能压在玻片标本上，下降镜筒或上升载物台也不能用力过猛，否则不仅会压碎玻片，还易损坏镜头。 6. 调焦 左眼从油镜中观察，同时转动粗调节螺旋，缓慢地提升油镜调焦，至出现模糊的物象时，再用细调节螺旋调节至物象清晰为止。如按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜下降不到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物象。遇此情况，应重新操作。调焦时，应特别注意误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及玻片。 7. 观察 仔细观察细菌的三种基本形态。 8. 显微镜用毕后的处理 上升镜筒，取下玻片，清洁油镜，