生化实验一-lowry法测Pr含量（副本）.ppt

生物化学与分子生物学系 杨 芬 实验室规则 按规章操作，保障实验安全； 进入实验室要着白大衣；禁止进食和饮水 禁止大声喧哗，保持实验环境的安静； 维持实验室的整洁。 实验分组 实验室卫生 实验报告的书写 实验名称 姓名： 班级： 学号： 实验原理： 实验目的： 实验步骤：文字简洁，尽可能采用图表 实验结果：原始数据、计算过程、结论 实验讨论：结果分析、实验注意事项 实验日期： 同组人员： 实验报告的书写 一、玻璃仪器的常规清洗 二、试剂瓶、吸量管、试管的放置 基 本 操 作 三、刻度吸量管的使用 四、微量移液器的使用（加样枪） 一、玻璃仪器的常规清洗 二、试剂瓶、吸量管、试管的放置 1、清洗剂洗刷 2、自来水冲洗3-5 遍 3、蒸馏水冲洗2-3 遍（2-3ml/次) 4、倒扣放置 1、试剂瓶用后放回原处、标签面向自己 2、吸量管尖头朝下放置，以免倒流 3、空置干净试管倒扣放在试管架上 选、吸、平、减、吹 三、刻度吸量管的使用 四、微量移液器的使用（加样枪） 单通道数字可调式移液器 多通道手动可调式移液器 1、看清加样枪规格。 2、仔细调节旋钮至所需刻度。 3、安装枪头。 4、压至一档，吸取溶液。 5、放出溶液：压至二档。 实验一 改良Lowry氏法测定蛋白质含量 蛋白质常用的定量方法 1.凯氏定氮法 2.紫外吸收法 3.呈色法 双缩脲法 酚试剂法 一、实验目的： 1、学习改良Lowry氏法测定蛋白质含量的原理及方法 2、了解标准曲线在物质定量测定中的应用及绘制要点 二、实验原理 ： Pr Cu2+ OH- Pr-Cu2+ 螯合物(紫红色) 酚试剂 钼蓝-钨蓝混合物 (蓝色) （双缩脲反应） 优缺点 缺点：费时较长，而且要精确控制操作时间。 显色程度与时间有关。 专一性较差，干扰物质较多。 酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油以及含有巯基、酰胺基、伯胺基的化合物等均可干扰。 优点：灵敏度高 双缩脲法的检出限为0.2~1.7mg/ml， 而本法的检出限为0.015~0.110mg/ml。 三、实验步骤： 标准曲线的绘制及样品测定 试剂 （ml） 标准曲线绘制 样品 测定管 0 1 2 3 4 5 Pr标准液 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 待测血清1.0 生理盐水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 试剂A 0.9ml, 混匀后，37℃水浴10min 试剂B 0.1ml, 混匀后，室温放置10min 试剂C 3ml, 立即混匀，37℃水浴10min 分光光度计以波长650nm依次比色读取光密度值 分光光度计 分光光度计的原理 分光光度计的操作 拉杆，1-4档 样品池 读数 波长 光 源 I0 I 单色器 样品池 狭缝 检测系统 分光光度计的构造 T = I/I0， A = - lg T Lambert-Beer 定律 A = KcL 分光光度计的原理 I0 I L K：吸光系数 c：溶液浓度 L：溶液厚度 c A标/A测= c标/c测 A：吸光度 T：透光度 2. 标准曲线法 分光光度计的使用 1、打开分光光度计，预热20-30min。 2、调节旋钮至需要的光波长。 3、检查拉杆是否在分光光度计的休息状态。 T档 拉杆1档 空白管 调T 100% ： T档 拉杆1档半 调T 0% ： A档 拉杆2、3、4档 测吸光度 标准管，测定管 休息状态：拉杆1档半 四、结果： 1、标准曲线的绘制和实测样本浓度的求得 实测Pr含量 2、浓度换算 待测蛋白浓度（g/L）=实测Pr浓度×稀释倍数 五、注意事项： 1、测定管蛋白浓度应在0.015-0.110mg/ml； 2、各管加试剂C必须快速，并立即摇匀，不应出现混浊； 3、精确控制操作时间。 * * * * * * * *