- 1、本文档共149页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
第二节 基因克隆操作
? 意义
? 基因克隆常用工具
? PCR
? 基因文库构建
? 基因的筛选与鉴定
一、基因分离的意义
? 特有基因:生物进化,木本果树与草本植物不
同,更复杂;目的不同,果树以生产果实为目
的;多年生,控制更复杂,影响因素也更多。
? 通过分离的基因,对生理现象遗传控制的分子
机理进行研究,这是无法以拟南芥代替的。例
如,果树童期分子机理的研究。
? 互相促进,相辅相承。
2. 基因分离
的工具
就像在一堆稻草里寻
找一根针一样,一段
特殊DNA序列的分离
过程十分困难。一般
都需要在大肠杆菌扩
增与表达。
1973年Cohen完成第一个基因操作实验
经体外重组获得杂合DNA
杂合子转化入大肠杆菌
?所需元件:
限制性内切酶
连接酶
载体
受体细胞
二、基因分离常用工具
? ①限制性内切核酸酶
? ②连接酶
? ③聚合酶
? ④载体
? ⑤受体细胞
限制性内切酶的特点
1、有特定的识别序列,通常为4-6个碱基的回
文对称序列。
2、切割位点位于识别序列内的固定位置上,切
割后在5’末端有磷酸基团,3’末端有羟基。
3、切割后形成粘性末端或平末端,前者又分为3
突出端(如PstI)和5’突出端(如EcoRI)两种
4、其活性发挥只需Mg2+作辅酶。
EcoR I:
5’ -- NG 3’ 5’ AATTCN -- 3’
3’ -- NCTTAA 5’ 3’ GN -- 5’
BamH I:
5’--NG 3’ 5’GATCCN--3’
3’--NCCTAG 5’ 3’ GN--5’
EcoRV
5’ --NGATATCN--3’
3’ --NCTATAGN--5’
5’--NGAT 3’ 5’ ATCN--3’
3’--NCTA 5’ 3’ TAGN5--’
5’--NGGATCCN--3’
3’--NCCTAGGN--5’
5’ --NGAATTCN--3’
3’ --NCTTAAGN--5’
②连接酶
体外催化磷酸二酯键的形成可使用两
种酶:大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶,
但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都
是首选的酶,因其能在正常的反应条件下
能有效的将平端连接起来。
各种连接酶特性的比较:
T4DNA
Ligase
E.coli DNA
Ligase
T4 RNA
Ligase
Ligases of
thermophilic
bacteria
最适pH
辅酶
7.2-7.8
ATP
7.5-8.0
NAD
7.2-8.4
ATP NAD
平滑末端 可能 * 不能 NO
DNA 5’P末端和
RNA 3’OH末端
可能 可能 不能 NO
RNA 5’P末端和
DNA3 ’OH末端
可能 不能 不能 NO
RNA和RNA 少数 可能 不能 可能 NO
③聚合酶
? 催化DNA的合成
? E.coli DNA聚合酶I: 聚合和外切活性
用来切口平移标记,末端标记
? Klenow DNA聚合酶:补平3’凹端,抹平3’凸
端,随机引物标记。
? 耐热DNA聚合酶:TaqDNA聚合酶,Vent DNA聚
合酶,pfuDNA聚合酶。
? 反转录酶:AMV, MMuLV
? T4/T7噬菌体DNA聚合酶
载体必备条件:
1. 含有复制子,载体在受体细胞中能大量繁殖,
其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大
量扩增;
2. 有1到几个限制内切酶的单一识别与切割位
点,便于外源基因的插入;
3. 具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记
等)以此知道它是否已进入受体细胞,并据
此标记将受体细胞从其他细胞中分离出来。
④ 克隆载体
载体类型
? A. 质粒载体
? B. 噬菌体载体
? C. 粘粒载体
? D. BAC/YAC载体
? E. 其他
l质粒是染色体之外的一种稳定的遗传因子,具
有自主复制和转录能力
l是双链闭合环状DNA分子
l大小在1-20kb之间
l它可独立游离于细胞质中,也可整合到细菌染
色体上。
质粒的基本特点
质 粒
pCAMBIA1301和pCAMBIA1391的区别
?
标记基因
? 抗生素基因:四环素抗性基因 Tetracycline
氯霉素抗性基因Chloramphenical
卡那霉素抗性 Kanamycin
新霉素抗性 Neomycin
氨苄青霉素
您可能关注的文档
- 药英 biopharmaceutics.pdf
- 药英 Gene therapy-New development in medicinal chemistry.pdf
- 药英 How to read the package insert for medicines.pdf
- 药英 Vitamins.pdf
- 一个基于J2EE平台的网上定货系统.pdf
- 医学免疫学-孙可一1 概论.ppt
- 医学仪器与测量教学 10.20 概论-刘老师.pdf
- 医学仪器与测量教学 10.27 心电测量及仪器.pdf
- 医学仪器与测量教学 11.03 脑电测量及仪器.pdf
- 医学仪器与测量教学 11.05肌电测量及仪器.pdf
文档评论(0)