分离科学第八章高效毛细管电泳.ppt

高效毛细管电泳 (High performance capillary electrophoresis, HPCE) ? 高效毛细管电泳是离子或者荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按照其淌度和/或分配系数不同，实现高效、快速分离分析的一种电泳新技术。;电泳技术发展历程： 1937年瑞典科学家Tiselius首次采用电泳技术，分离人血清中5种蛋白。 1981年Jorgenson用75μm内径毛细管，利用区带电泳实现了正负离子的分离分析，成为毛细管电泳技术的里程碑。 1983年，Hjerten发展了毛细管凝胶电泳。 1984年，Terabe等发展了胶束电动色谱，使中性化合物的CE分离成为可能。 1987年，Hjerten提出了毛细管等电聚焦电泳。 1989年出现商品CE仪器，为推广应用起到了促进作用。;毛细管电泳特点 分离模式多，转换容易，适用范围广。 分离效率高。理论塔板数40万块/m。 速度快。多数<30min，最快几秒钟。 试剂和样品消耗少。分离溶剂仅为几μl，进样量nL（10-9L）级。 成本低，操作简便，环境污染小。 应用领域十分广泛。在生命科学、药学、医学、中药分析、食品化学、环境化学和法医学等领域都得到广泛的应用。;毛细管电泳基本原理 预备知识：双电层和Zeta电势 双电层 由界面化学可知，固体与液体接触时，固体表面分子离解或者（和）表面吸附溶液中的离子，在表面形成双电层。;吸附层 （紧密层）; 当?d衰减到原来的1/e时，离紧密层的距离定义为扩散层的厚度（?）。 Zeta电势正比于扩散层厚度? 。毛细管壁上的Zeta电势为： ; 带电粒子在其有效半径所组成的面存在Zeta电势：;电泳（Electrophoresis） 在半导电流体中，带电粒子在外加电场作用下的泳动现象叫电泳。带电粒子的移动速度可以表示为：;影响电泳速度的因素： 电场强度E 介质特性（介电常数和粘度?） 粒子的有效电荷 粒子大小和形状 因此，荷质比差异是电泳分离的基础。;淌度（Mobility, ?） 因为电泳速度与外加电场强度有关，所以，在电泳中常用淌度而不用速度来表示带电粒子的电泳行为和特性。 ;有效淌度（effective mobility,?ef） 有效淌度是实验测出的离子淌度，它是所有产物的离解度（?i）和分子的第i离子形式的绝对淌度乘积之总和：;电渗流（Electroosmotic flow, EOF） 在毛细管中，电渗流指的是体相溶液在外加电场下整体朝一个方向运动的现象。;电渗流在CE中的意义 将正、负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移 通过EOF的大小和方向的控制，还可以影响CE 的分离效率，选择性和分离度 EOF的细微变化会影响CE分离的重现性（迁移时间和峰面积）。 ;EOF速度的大小与毛细管管壁的Zeta电势有关： ;影响电渗流的因素主要有： 电场强度E 毛细管材料 溶液的pH 电解质溶液的成分和浓度 添加剂 温度 ;?eo ~ E关系曲线;EOF和pH的关系曲线 ;电解质溶液的成分和浓度;添加剂对EOF的影响 中性盐（K2SO4），双电层变薄，EOF降低； 两性离子（四甲基氯化铵）增加溶液粘度，降低pH，EOF降低； 有机溶剂甲醇、乙腈等降低离子强度（有利于提高Zeta电势）、粘度。但通过氢键或偶极作用于管壁，改变表面电荷，这些共同作用的结果一般使EOF变小。 表面活性剂，显著改变毛细管内壁的电荷特性。当表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度以后，将形成胶束，这个时候CE的分离机理会发生变化。;阳离子表面活性剂浓度对?eo的影响（pH9.1） ;温度对EOF的影响 温度对EOF的影响是线性的。EOF随温度的变化主要是温度影响粘度变化的结果。温度升高时，溶液粘度下降，因此EOF变大。 由于焦耳热的存在，毛细管内溶液的温度会发生变化引起柱效下降，以及分离时间重现性较差，因此，良好的散热是非常必要的。一般有空气冷却和液体冷却两种方式。;调控EOF的方法： 改变缓冲液成分和浓度 改变pH 加入添加剂 毛细管内壁改性（物理或化学方法涂层及动态去活） 改变温度 外加径向电场（改变管壁的Zeta电势）;溶质有效迁移速度和表观淌度 在CE中由实验决定的实际的离子迁移速度，称为有效迁移速度（vef）：;分离效率和分离度 理论塔板数 Giddings方程定义为：;分离度 ;区带增宽的因素 （1）扩散 径向扩散影响小，纵向扩散影响大 （2）进样;由焦耳热引起的分散系数可表示为：;控制焦耳热和温度梯