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RD细胞复苏_传代_冻存
RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞培养操作1)复苏细胞:将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入 4mL 培养基混合均匀。在1000RPM 条件下离心 4 分钟,弃去上清液,加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入 10cm 皿中,加入约 8ml 培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。2)细胞传代:如果细胞密度达 80%-90%,即可进行传代培养。? ? ?1. 弃去培养上清,用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。? ? ?2. 加 1ml 消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于 37℃培养箱中消化 1-2 min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。? ? ?3. 按 6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM 条件下离心 4 min,弃去上清液,补加 1-2mL 培养液后吹匀。? ? ?4. 将细胞悬液按 1:2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类;1. 细胞冻存时,弃去培养基后,PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶,细胞变圆脱落后,加入 1ml 含血清的培养基终止消化,可使用血球计数板计数。2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞,根据细胞数量加入血清和 DMSO,轻轻混匀,DMSO 终浓度为 10%,细胞密度不低于1x106/ml,每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液,注意冻存管做好标识。? ? ?3. 将冻存管置于程序降温盒中,放入-80℃冰箱,2h以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
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