实验八 荧光光光度法测定核黄素的含量.doc

实验八 荧光光度法测定核黄素的含量实验目的 1. 了解荧光法测定核黄素的原理和方法； 2. 学习荧光光度计的操作和使用。 实验原理 某些具有π-π电子共轭体系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激发，如该物质具有较高的荧光效率，则会以荧光的形式释放出吸收的一部分能量而回到基态。建立在发生荧光现象基础上的分析方法，称为分子荧光分析法，而常把被测物称为荧光物质。在稀溶液中，荧光强度IF与入射光的强度I0、荧光量子效率?F以及荧光物质的浓度c等有关，可表示为IF=K?FI0εbc。式中为比例常数，与仪器的参数固定后，以最大激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光的强度时，荧光强度IF与荧光物质的浓度c成正比。 核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物，它在中性或弱酸性的水溶液中为黄色并且有很强的荧光。这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下： 核黄素的激发光波长范围约为440—500nm（一般为440nm），发射光波长范围约为510—550nm（一般为520nm）。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比，由还原前后的荧光差数可进行定量测定。根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。 注意：在所有的操作过程中，要避免核黄素受阳光直接照射。 仪器与试剂 实验试剂：核黄素标准品；冰醋酸；核黄素药片；连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠 实验仪器：荧光光度计（F-2500型） 天平（感量0.0001g） 实验器材 普通试管： 25mL×9 容 量 瓶： 100mL×1 移 液 管： 10mL×1 5mL×1 1mL×1 烧 杯： 50mL×1 滤 纸： 9cm 研钵、漏斗、洗瓶、洗耳球、试管架、移液管架、玻棒：各1 实验内容 核黄素标准液（4×10-6g·mL-1） 准确称取核黄素4mg，加5mL冰醋酸和适量蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。冷却至室温，用蒸馏水定容至1000mL。转入棕色瓶中。 样品液的制备 为了消除药片之间的差异，可取几片药片一起研磨，然后取部分有代表性的样品进行分析。 将5片核黄素药片称量后磨成粉末，然后从中准确称取1-2mg有代表性的样品，加0.5mL冰醋酸和适量蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。冷却至室温，用蒸馏水定容至100mL（如果有沉淀，迅速通过定量滤纸干过滤，用该滤液在与标准溶液同样条件下测量核黄素的荧光强度）。转入棕色瓶中。作样品待测液备用。 绘制核黄素的激发光谱和荧光光谱 1）.固定激发波长λex（Excitation spectra）为440nm,在460-660nm处测定荧光强度，得溶液的发射光谱，在520nm处得最大发射波长λem。 2）.再固定发射波长λem（emissionspectra）为520nm，测定激发波长λex为400-500nm处荧光强度，得溶液的激发光谱，在440nm处得最大激发波长λex。 标准曲线制作及样品测定 取8支试管，按下表所示顺序操作。 管 号 操 作 标准核黄素浓度梯度 样品 1 2 3 4 5 6 Ⅰ Ⅱ 核黄素标准液(mL) 25 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 样品待测液(mL) 1010.00 蒸馏水(mL) 9.75 9.59.00 8.50 8.00 7.50 荧光测定 激发波长= nm，发射波长= nm， 分别测定各管的荧光强度。 F1 还原反应 在各管中分别加入约10mg的连二硫酸钠或亚硫酸钠，混合溶解后，立即重新测定荧光强度F2 F2 注意：在测定中如果待测样品溶液的荧光强度超出100%，则需要再行稀释，并记录稀释倍数。 结果处理 从绘制的激发光谱和荧光光谱曲线上，确定它们的最大激发波长和最大发射波长。 由1～6号管的数据，以核黄素含量(10-6g·mL-1)为横坐标，F值（F1-F2）为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线； 求两个样品管F的平均值； 由从标准曲线中求样品管中核黄素的含量(10μg·mL-1)； 计算药片中核黄素的含量（单位用g/g鲜重），并将测定值与说明书上的值比较。 六注意事项 1.在所有的操作过程中，避免核黄素受阳光直接照射。 2. 使用石英样品池时，应手持其棱角处，不能接触光面，用毕后，将其清洗干净。 3. 影响荧光强度的因素很多，每次测定的条件很难完全控制一致，因此每次必须做工作曲线，且标准曲线最好与样品同时做。 1 . 先打开仪器主机，打开电脑 2 . 点击桌面－Solutions 3 . 寻找激发波长：放入样品，寻找激发波长，点击 Method ，出现对话框，点