第四章基因的鉴定与表达分析.ppt

动物基因组印迹杂交(Zoo blot)是基于人类及其他动物在长期进化中普遍存在基因的同源和保守序列的理论设计的。该方法采用同一基因单拷贝的分子探针与各种动物的基因组DNA作Southern印迹杂交筛选，如果杂交表现为阳性，表明所用的探针中可能包含进化过程中的保守序列，即序列间有很高的同源性，该序列可能是外显子或编码表达基因区域，进而分离基因组中的表达序列。 主要步骤： 制备载体→将基因组片段亚克隆至表达载体中→转化到E. coli中扩增→提取重组质粒并转染至COS-7细胞中→提取RNA→合成cDNA→一级PCR扩增、二级PCR扩增某一克隆PCR产物→鉴定所克隆的外显子。 基因组图谱绘制和基因定位克隆的常见问题是大片段基因组编码DNA的鉴定。为解决此问题，1991年，Parimoos 等首先提出了cDNA选择法。 这是一种以表达为基础的基因分离技术，通过形成异源双链从基因组克隆中识别表达序列的方法。 原理： 把基因组DNA固定在膜上，用总cDNA与之杂交，通过PCR从中回收可与基因组DNA结合的cDNA片段。 优点： 最大优越性在于PCR反应的介入，大大提高了选择的灵敏度，可以检测到一些稀有转录子。 CpG岛(CpG island)是基因组DNA序列中富含C、G的DNA区域。在大规模的DNA测序中，每发现一个CG岛，意味着在此区域有一个基因。利用CpG岛稀有酶如SacⅡ、BssHⅢ、EagⅠ、HpaⅡ、NotⅠ识别其位点，切割基因组DNA。CpG岛又称HIF岛，即用HpaⅡ酶将CpG岛周围的DNA切成许多小片段，这些序列称为HIF序列。 原理： 用位于CpG附近的序列作探针，从总DNA文库或cDNA文库中得到转录子，鉴定表达基因。 生物体在不同发育阶段、不同生理状态下、不同类型细胞或组织中的结构与功能变化的差异归根结底是基因在时间与空间上的选择性表达差异，即为基因的差异表达。基因差异表达的研究策略主要建立在基因转录和翻译的调控过程中，即mRNA或cDNA差异和蛋白质差异两个水平，包括mRNA差异显示、消减杂交和二维电泳技术等。 原理： 利用真核细胞，mRNA均含有Poly A末端的特点，把3’端引物设计成T12MN(M,N表示4种碱基中的一种，M不能为T),5’端设计成20条含10多个碱基的随机引物。通过随机组合，利用逆转录PCR技术，将基因背景相同的两个或多个组织或细胞的总RNA或mRNA反转录为双链cDNA并进行扩增，再将这些大小不一的RT-PCR产物进行聚丙烯酞胺凝胶电泳，纯化和克隆差异片段，并进行测序，即可得到差异表达的基因序列。 步骤: mRNA反转录为cDNA并进行PCR扩增； 电泳分离RT-PCR片段； 将差别表达条带(RT-PCR产物)进行回收，克隆和测序分析等。 原理： 在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)和十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)，把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分离展开。 步骤： 样品制备→等电聚焦→平衡转移→ SDS—PAGE→斑点染色→图像捕捉和图谱分析→质谱鉴定→基因组DNA或cDNA文库筛查等步骤。 克隆全长cDNA 确定转录起始点 确定外显子——内含子边界 翻译起始位点 翻译终止信号 表达序列标签（expressed sequence tags，ESTs） 指从不同组织来源的cDNA文库中随机挑选克隆进行5’或3’端测序后得到的部分cDNA序列。一个EST代表生物体某种组织某一时期的一个表达基因，其长度一般为300一500bp，一个完整的cDNA序列可能包含有多个重叠的EST。由于EST提供了与表达基因相关的“标记”( tag)，因此，通过延伸EST序列可以获得部分乃至全长cDNA序列，将为发现疾病基因提供了一种快速而有效的途径。 采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNA，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。 目前比较常用的EST或包括EST的数据库: dbEST；GcnBank；EMBL-EBI；DDBJ；TDB；ATCC 步骤： (1)建立某种组织或细胞的cDNA文库； (2)随机挑取cDNA克隆进行自动测序； (3)将所得的EST数据与dbEST等数据库的数据比较，确定未知基因； (4)进一步分析未知基因以获得组织或细胞的基因表达概况。 其他步骤：可以基于EST数据库由一个己知的基因利用一些软件系统寻找同