RNA干扰 - 鲍晓明－山东大学生命科学院酵母遗传学及分子 .ppt

siRNA的转染 磷酸钙共沉淀 将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。 siRNA的转染 电穿孔法 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。 siRNA的转染 DEAE-葡聚糖和polybrene 带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子结合使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。 siRNA的转染 机械法 转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。 siRNA的转染 阳离子脂质体试剂 在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。 siRNA的转染 1.纯化siRNA 2.避免RNA酶污染 3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 4.避免使用抗生素 为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点： 回顾： PPT的制作： 讨论： 展示： 收获： 感谢： 在药物开发过程中，用RNAi技术可以对靶基因的功能进行分析，有助于搞清药物的作用机制以及与基因编码产物，及与相应化合物的相互作用，从而更正确地发现药靶，开发更有效的候选药物。 4.药物开发 总之, RNAi作为偶然发现的一种生物体的自然现象, 发现者本身可能并没有预料到其应用前景及潜在的价值, 但随着众多的研究人员的加入, 一个具有划时代意义的技术将有望使人类摆脱疾病的困扰. siRNA实验技术 1. siRNA的设计 2. siRNA的制备 3. siRNA的转染 (一)siRNA的设计 (1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。 (2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列同源的序列。 (3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 (1)RNAi目标序列的选取原则 siRNA的设计 (2)阴性对照 一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。 (二)siRNA的制备 在非哺乳动物细胞的研究中，由于利用较长的双链就可以诱导RNAi而无须合成siRNA，因此设计RNAi实验的步骤比较简便。只要通过目的基因体外转录就可得到所需要的dsRNA，再通过浸泡、注射或转染靶细胞即可。然而在哺乳动物细胞内，较长的dsRNA(多于29个核苷酸)会导致非特异基因沉默，只有21个核苷酸大小的siRNA才能有效引发特异的基因沉默，所以RNAi的设计与非哺乳动物的有所不同。目前制备siRNA的方法主要有两类，即体外制备和体内表达，两者最大的不同在于：前者直接作用于RNA，而后者的对象则是DNA。根据具体工具不同可进一步划分为5种RNAi实验方法。 siRNA的制备 体外转录法 siRNA表达载体 化学合成法 制备siRNA 的混合物 siRNA表达盒子 siRNA的制备 化学合成法 这种方法比任何其他方法都要昂贵，但是化学合成siRNA几乎不需要研究者的操作。 应遵循以下步骤：(1)扫描靶基因中的序列，记录每个3 ' 端19个核苷酸作为可能的siRNA靶位点；(2)筛选G／C含量较低的序列；(3)可能的序列要经适合的基因组数