生物化学15摘要.ppt

* 第十五章?? 核酸的研究方法 一、核酸的分离、提纯和定量测定 二、核酸的超速离心 三、核酸的凝胶电泳 四、核酸的核苷酸序列测定 五、DNA聚合酶链反应（PCR） 六、DNA的化学合成 一、核酸的分离、纯化和定量测定 尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 抑制核酸酶。 （一）DNA分离 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀。 （二）RNA的分离 RNase 的灭活： 玻璃器皿：140-200℃，8h 塑料器皿：0.1%DEPC，37，过夜 提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍 反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂 ★用0.14mol/L NaCl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白。 ★异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法 ★异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法 蛋白质：＜1.33g/ml DNA：1.71g/ml左右 RNA：＞1.89g/ml ★mRNA的制备： oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法 （三）核酸含量的测定方法 核酸纯度的鉴定可通过测定样品在260 nm和280nm的光吸收比值，进一步的鉴定可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。 ①磷的测定 RNA中含磷量为9.0％，DNA中含磷量为9.2％，因此每测得1g磷就相当于含有11g核酸。含磷量的测定是用浓硫酸将核酸消化，使其有机磷变成无机磷，然后与钼酸铵定磷试剂作用，生成蓝色的钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，可在660nm比色测定。从磷的标准曲线可知样品中磷的含量，从而求出核酸的含量。 ②核糖和脱氧核糖的测定 RNA中核糖的测定用苔黑酚（3，5-二羟甲苯）法，利用RNA与浓盐酸和3，5-二羟甲苯作用生成绿色物质，在670 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的RNA的含量。 DNA中脱氧核糖的测定用二苯胺法，利用DNA在酸性条件下（冰醋酸和少量浓硫酸）与二苯胺作用生成蓝色化合物，在595 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的DNA的含量。 ③紫外吸收的测定 实验室中最常用的是首先测定样品在260 nm和280 nm的光吸收值（A值），从A260／A280的比值可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。对于纯的样品，只要读出260mm的A值即可算出含量。通常以1A值相当于50μg/mL双螺旋DNA或40μg/mL单链DNA（或RNA）或20μg/mL寡核苷酸计算。这个方法既快速，又准确，而且不会浪费样品。 二、核酸的超速离心 不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用CsCl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来 这一方法常用于质粒DNA的纯化。 （一）核酸密度的测定 8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml（底部）～1.55g/ml（顶部） 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 ρ=ρ0 +4.2ω2（r2 - r02） × 10-10 ρ ：浮力密度 ω ：角速度（弧度/秒） r：样品到转轴的距离 （二）测定DNA的G-C含量 G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系 ρ=0.100xG-C + 1.658 xG-C = （ ρ-1.658）× 10 但含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值。 （三）溶液中核酸构象的研究 浮力密度： RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质， 变性程度越大，浮力密度越大 超螺旋DNA或 三、核酸的凝胶电泳 （一）琼脂糖电泳 影响迁移率的因素： ①?核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比②?凝胶浓度③?DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢④?电流，不大于5V/cm 染色：0.5μg/ml EB（溴化乙锭） RNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛 用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广。 琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定 琼脂糖电泳还可以用于DNA的制备与纯化 （二）PAGE电泳 用于小片段DNA的分析，精度非常高 四、核酸的核苷酸序列测定 （一）双脱氧终止法 英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构， 195