【生物】植物DNA、RNA与蛋白提取与分析.ppt

植物DNA、RNA及蛋白的提取与分析 DNA提取原则 保证DNA结构的完整性 排除有机溶剂和金属离子的污染 排除其它核酸分子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 纯化后不应存在对酶抑制性的物质 植物DNA提取的方法 CTAB法 SDS法 煮提法 DNA提取的基本步骤 材料的准备（新鲜或冷冻保存） 细胞的裂解（液氮研磨，释放内容物） DNA的分离与纯化（酚氯仿抽提） DNA的沉淀与洗涤（2V无水乙醇或2/3V异丙醇） DNA的干燥与溶解（ddH2O或TE） CTAB法流程 CTAB提取液主要成分 CTAB： 十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。 Tris-HCl(pH8.0): 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。 EDTA:螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性。 NaCl: 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。 CTAB法步骤 注意事项 1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。 2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。 3. 在提取过程，应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。 DNA的质量检测 电泳 带型单一无拖尾现象 点样孔无残留杂质 OD值测定 DNA纯品的OD260/OD280为1.8，若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。 分离RNA的目的 RT-PCR Northern blot 构建 cDNA文库 Gene Chips 体外翻译 RNA提取的关键--防止RNase降解RNA 实验失败的主要原因是RNA酶的污染。 RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。研究人员的手、唾液、灰尘、器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、各种试剂及各种组织和细胞中。 RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。 在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。 1. 耐高温的器具（如玻璃制品、研钵、剪刀、镊子 等）于180 ℃下干烤8h 2. 塑料耗材（Tip、EP管等）用0.1%的DEPC水浸泡过夜，然后高压，再烤干备用 3. 实验用的氯仿、乙醇为RNA专用，水为DEPC处理水 4. 使用有效的RNase抑制剂：如异硫氢酸胍、RNasin 5.配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制 6. 实验过程需带一次性塑料手套且经常更换 7.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 常用的RNase抑制剂 DEPC(焦磷酸二乙酯):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 异硫氢酸胍∶目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 RNasin(RNA酶的蛋白质抑制剂）一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 TRI?Reagent提取总RNA TRI Reagent含有异硫氰酸胍和苯酚，能够有效溶解RNA，DNA和蛋白质。在加入氯仿并离心后，上层水相中含有RNA。水相的RNA经过沉淀和洗涤后几乎没有DNA或者蛋白质污染 TRI?Reagent提取步骤 1. 研钵研杵预冷后,加入少量样品用液N迅速研磨成冰粉状 2. 将样品（样品量不超过100mg)移入1.5mlEP管中,迅速加入1mlTRI Reagent混匀,室温静置5min 3. 加0.2ml氯仿,剧烈振荡15S,室温静置10min 4. 4℃,12000g,15min;取上清于另一EP管中，加0.5ml异丙醇混匀，室温静置10min 5. 4℃,12000g,8min ；去上清，加1ml75%乙醇，涡漩沉 淀 6. 去75%乙醇，室温晾干5~10min 7. 加30~50ul