实验五酵母核糖核酸的提取及组分鉴定.pdf

实验五 酵母核糖核酸的提取及组分鉴定 一、实验目的 1．了解并掌握稀碱法提取核糖核酸（RNA）的原理和方法； 2．掌握苔黑酚显色法鉴定RNA组分的基本原理和操作方法。 二、实验原理 酵母中含有丰富的RNA，含量达2.67%～10.0%，而DNA 含量很少，仅为 0.03%-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。提取制备RNA 的方法较多，一 般有苯酚法，去污剂法、浓盐法和稀碱法等。其中苯酚法是实验室中最常见的方 法。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性 的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。 本实验用稀碱法提取RNA。先用稀碱（本实验用0.04mol/L 的NaOH溶液） 使酵母细胞裂解，RNA可溶于稀碱溶液，在碱性提取液中加入酸性乙醇可使核糖 核酸沉淀出来，由此即可得到RNA 的粗制品。RNA含有核糖、嘌呤碱，嘧啶碱和 磷酸各组分，加入硫酸煮沸可使RNA水解，从水解液中可用定糖、定磷和加银沉 淀等方法测出上述组分的存在。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）100mL烧杯 1个； （2）移液管：2.0mL1个，5.0mL1个，1.0mL4个； （3）量筒：10mL1个，50mL1个； （4）试管：15mL4个； （5）恒温水浴锅 （6）离心机； （7）布氏漏斗； （8）抽滤瓶； （9）研钵； （10）滴管； （11）洗耳球； （12）电子天平。 2．试剂 （1）0.04mol/L的NaOH溶液； （2）95%乙醇； （3）乙醚； （4）1.5mol/L的硫酸； （5）浓氨水； （6）0.1mol/L的硝酸银； （7）酸性乙醇溶液：0.3mL浓盐酸加入30mL乙醇中； （8）三氯化铁浓盐酸溶液：2mL10%的三氯化铁溶液加到400mL浓盐酸中。 （9）苔黑酚乙醇溶液：称取6g苔黑酚溶于100mL95%乙醇中（可在冰箱中 保存1个月）； （10）2.5%钼酸铵溶液 3．材料 干酵母粉 四、操作步骤 1．酵母RNA 提取 称2g干酵母粉置于研钵中，加少许石英砂和4mL0.04mol/LNaOH溶液，在研 钵中充分研磨，然后将匀浆液转移到 100mL的烧杯中，再用6mL0.04mol/LNaOH 溶液分两次洗涤研钵，洗涤液并入匀浆液中，沸水浴上加热30min，经常搅拌。 冷却后倒入离心管中，3000r/min离心15min。将上清液小心倒入10mL酸性乙醇 的小烧杯中，边加边搅动。加毕，静止，待RNA沉淀完全后，离心3min。滤渣 用95%乙醇洗两次，每次5mL。洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀，即得RNA粗 品。如欲得到RNA粉末，可再用乙醚将沉淀转移到布氏漏斗中抽滤，沉淀在空气 干燥。称量所得RNA粗品的质量。 2．RNA组分鉴定 向沉淀中（本实验可不用乙醚洗涤干燥）加入1.5mol/L的硫酸6mL，转移 到大试管中沸水浴加热10min，制成水解液，然后进行组分鉴定。 （1）嘌呤碱鉴定：取1mL0.1mol/L的硝酸银，逐滴加入浓氨水至沉淀消失， 然后加入1mL水解液，放置片刻，观察有无白色嘌呤银化合物沉淀产生。 （2）核糖鉴定：取1mL水解液，加入2mL三氯化铁浓盐酸溶液和0.2mL苔 黑酚乙醇溶液，沸水浴5~10min，观察核糖是否变成绿色。 （3）磷酸鉴定：取2ml水解液，加5滴硝酸银和1mL钼酸铵，沸水浴加热， 观察有无黄色磷酸铵沉淀产生。 五、结果处理与分析 酵母中RNA 的百分含量= （RNA粗制品质量g/酵母质量g)×100% 酵母组分鉴定结果和分析。 【注意事项】 1. 总是要戴着手套。 2. 总是要用不含RNA酶的样品管、移液器枪头、塑料容器和溶液。 3. 苔黑酚法特异性较差，凡是戊糖均有反应，微量DNA无影响，较多D A 存在时，亦有干扰作用。 【思考题】 1．为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？ 2．在提取RNA 的过程中，为什么在沸水浴上加热30min？RNA会被破坏吗 ? 【参考资料】