根癌土壤杆菌介导的遗传转化.doc

根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展 摘要：根癌农杆菌介导的遗传转化系统因具有操作简便，转化效率高，容易得到单拷贝随机插入的转化子，并且转化子稳定等特点而成为近年来丝状真菌遗传转化的主要研究手段之一，也使该系统有可能成为丝状真菌基因组研究的有力工具。本文就根癌农杆菌转化丝状真菌原理、过程、种类、影响转化效率的因素及其应用等方面进行了综述。 　　 [［关键词]］ 根癌农杆菌；丝状真菌；遗传转化 丝状真菌(（filamentous fungi)) 是真菌中一个很大类群，通常指那些菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。其在自然条件下常引起食物、工农业产品的霉变和植物的真菌病害,，在工业、农业、医药及基础生物学研究中具有重要作用。丝状真菌中很多种具有重要的经济价值,，还有一些是昆虫、植物、动物和人类的重要致病菌,，如绿僵菌(（Metarhizium anisopliae))、稻瘟菌(（Magnaporthe grisea))和烟曲霉(（Aspergillus fumigatus))等.。而构巢曲霉(（Aspergillus nidulans))和粗糙脉孢霉(（Neurospora crassa))由于结构简单,，通常被作为真核微生物的“模式”种用于基础研究[［11]］.。由于丝状真菌在经济上和科学中的重要性,，多年来一直被广泛地研究.。 近年来发展了很多转化的方法,，但并非所有方法都适用于丝状真菌.。 以往丝状真菌的常规转化方法有PEG介导的原生质体转化，限制酶介导的插入突变(（Restriction enzyme-mediated insertional,， REMI))等,，但是这些转化技术或需要制备原生质体、或转化效率低．阻碍了它们在研究丝状真菌功能基因中的应用。根癌农杆菌介导的转化体系(（Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,，ATMT))克服了这些缺点．为丝状真菌的遗传转化和功能基因研究提供了有力的工具，现已被广泛地运用于丝状真菌的遗传操作目前已经实现了对泡盛曲霉(（Aspergilus awamori))、粗糙脉孢菌(（Neurospora crassa))、尖孢镰刀菌(（Fusarium oxysporum))和瓜类炭疽(（Colletotrichum lagenarium))等6600多种真菌的遗传转化[［22]］。 11、根癌农杆菌介导遗传转化的丝状真菌的原理和种类 根癌农杆菌是革兰氏阴性土壤杆菌．自然情况下它可通过伤口侵入植物导致受伤部位产生瘿瘤，并将其T-DNA序列转入植物细胞并整合到植物染色体上 [［53］1．利用这一原理得到第一批能表达外源基因的转基因植物。根癌农杆菌正被广泛地应用到植物的遗传转化中。在大肠杆菌与酵母菌能够通过接合的方式将前者的质粒转移到后者［4］和农杆菌转化植物等现象的启下，Bundock 等人尝试用根癌农杆菌介导酵母菌的遗传转化，发现根癌农杆菌可以转化酿酒酵母(（Saccharomyces cerevisiae))[［651］，显示了根癌农杆菌能够转化除植物以外的其他物种。许多科研工作者也纷纷投入到利用该方法对其他真菌的遗传转化的工作中，拓宽了根癌农杆菌的转化范围。 与根癌农杆菌介导植物遗传转化相似，农杆菌转化真菌时，同样需要vir(（virulence))基因的活化，即T-DNA(（transferred DNA))转移至真菌同植物一样是依赖于毒性系统的。Michieise等利用一系列毒性蛋白基因缺失的农杆菌突变体转化Aspergillus awamori，以阐明不同毒性蛋白在T-DNA转移至A．awamori的作用。研究结果显示，任何一个调节蛋白(（VirA，VirG))，或者是转运通道蛋白(（virB))，或是T链复合物形成蛋白(（VirD，VirC，VirE22))的失活都会严重的降低转化效率。这一结果表明，农杆菌介导A．awamori的高效转化需要一个完整的T-DNA转移机制。这些都证明农杆菌转化高等和低等真核生物的机理具有一定的保守性。然而，Michielse等的研究也显示，VirE33， VirH，VirF毒性蛋白，在农杆菌转化A．awamori的过程中并不是必需的。另有研究表明控制农杆菌向植物细胞附着的chvA，chvB及exoC基因在酵母的转化中也并非必不可少。因此，根癌农杆菌转化真菌的机理还需要由更多相关的试验研究来阐明。 22、丝状真菌ATMT转化大致过程 丝状真菌ATMT遗传转化过程比较简单,， 不需要复杂的仪器设备,， 且基本相同，依次为构建二元载体、活化根癌农杆菌、准备真菌分生孢子和共转化，大致如下:： 根据实验目的构建二元载体，挑取携有双元载体的根癌农杆菌单菌落到含有相应抗生素的