建立细菌系统的双分子萤光互补试验做为α-突触核蛋白聚集抑制物筛检 .pdf

2016 年臺灣國際科學展覽會 優勝作品專輯 作品編號 080012 參展科別 生物化學 作品名稱 建立細菌系統的雙分子螢光互補試驗做為 α- 突觸核蛋白聚集抑制物篩檢平台 得獎獎項 大會獎：二等獎 就讀學校 臺北市立第一女子高級中學 指導教師 李桂楨、陳怡旴 作者姓名 黃郁婷、林佳蘭 關鍵字 雙分子螢光互補、蛋白質摺疊報告者、 α- 突觸核蛋白 排版\080012-封面 作者簡介 大家好 ！我們是黃郁婷和林佳蘭，目前就讀於北一女中二年級。到了高中後， 才知道有專題研究這門課，可以讓我們有機會提早接觸自己喜歡的實驗，探索不同 領域的新知，不只是侷限在教科書裡。 我們在這段日子裡，學到很多實驗方法、原理及精神，雖然真的很累，假日寒 暑假及放學，都待在實驗室，但更多時候是非常有趣的，尤其是成果出來時！做研 究的這段時光，我們很感謝教授、老師、學長姐和同學們，有了你們的幫助，讓我 們開開心心的進行實驗，過程中有時會有些小挫折，但在大家的努力下都一一解決， 謝謝你們！ i 摘要 帕金森氏症(PD是一種慢性中樞神經系統退化性疾病，患者臨床症狀包括靜止) 時 震顫、動作遲緩 、僵直及黑質緻密部多巴胺神經元的漸進性退化等。 PD的主要 病理特徵為多巴胺神經元中出現包含α- 突觸核蛋白(SNCA)錯誤摺疊、聚集的路易 小體。雖然PD的治療 方法包括給予左旋多巴或其他藥物 、物理治療 、手術等，至 今尚未有根治的方法。本研究建立雙分子螢光互補試驗與蛋白質摺疊報告者試驗兩 種原核細胞平台 ，作為篩檢可幫助α-突觸核蛋白摺疊的化學伴隨蛋白平台。雙分子 螢光互補試驗是將 Venus黃螢光蛋白改進版切開成 N 端(VN1-211)及 C 端(VC212-239) 二段，分別接在SNCA的 N 端(VN-SNCA或) C 端(SNCA-VC) ，原本沒有螢光的片 段可藉融合的 SNCA聚集的再組裝而出現螢光。當構築的 VN-SNCA and SNCA-VC 質體共表現於大腸桿菌後，蛋白質染色及免疫轉漬可偵測到表現的 VN-SNCA 、 SNCA-VC蛋白，並出現伴隨著 SNCA聚集所導致的互補螢光。我們以可干擾 SNCA 聚集的海藻糖來測試此聚集抑制物篩選平台，發現在不影響大腸桿菌生長的狀況 下，海藻糖的濃度與螢光下降程度呈正相關，推測因其能減少 SNCA聚集，導致 螢光分子互補的機率下降。蛋白質報告者試驗是將野生型 (WT)與突變型(35/46/61 E-to-K的) α-突觸核蛋白與綠螢光蛋白的融合蛋白(SNCA-GFP)分別表現於大腸桿 菌，突變型的 α-突觸核蛋白的傾向錯誤摺疊，會影響融合的綠螢光蛋白摺疊，而導 致綠螢光下降，而海藻糖的化學伴隨蛋白活性可幫助突變型的α-突觸核蛋白摺疊， 因而改善融合的綠螢光蛋白的摺疊，導致綠螢光上升。未來我們用此兩種原核細胞 平台，來篩檢可幫助α-突觸核蛋白摺疊的新穎化學伴隨蛋白。 1 Abstract Parkinson’s disease (PD) is a kind of chronic central nervous system degenerative disease associated with resting tremor, bradykinesia, rigidity, and progressive degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta. Characteristic pathological features of PD include proteinaceous α-synuclein (SNCA) positive inclusions called Lewy bodies in dopaminergic neurons.