麦芽四糖淀粉酶基因优化表达及酶学性质分析 - 生物通.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（５）：１００１０６ 麦芽四糖淀粉酶基因优化表达及酶学性质分析 赵　云　朱蓓霖　汪正华　周　杰　吴自荣　黄　静 （华东师范大学生命科学学院　上海　２００２４１） 摘要　麦芽四糖淀粉酶是一种新型外切淀粉酶，从淀粉的非还原末端特异地顺序切割第４个  α １，４糖苷键，产物为麦芽四糖，广泛应用于食品、医疗保健等领域。对来 自嗜糖假单胞菌 （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）的麦芽四糖淀粉酶基因序列进行优化，优化前后基因序列同源性达 ７５％。将优化合成的成熟肽基因克隆至原核表达载体 ｐＥＴ３２ａ（＋）上，转化大肠杆菌 ＢＬ２１ （ＤＥ３），经ＩＰＴＧ诱导，重组蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经变性、复性、多步纯化，获得有 活性的麦芽四糖淀粉酶。将麦芽四糖淀粉酶与不同来源的淀粉水解反应，结果表明，该酶能与７ 种不同来源的淀粉反应产生单一的麦芽四糖。经ＳＤＳＰＡＧＥ电泳，ＤＮＳ法和硅胶板薄层色谱分 析法（ＴＬＣ）进行酶学性质分析，结果表明麦芽四糖淀粉酶的分子量约为５７ｋＤａ，纯化后的酶液最 适反应温度为４５℃，最适反应ｐＨ为８．０。研究结果为麦芽四糖淀粉酶的研究和开发提供依据和 参考。 关键词　麦芽四糖淀粉酶　嗜糖假单胞菌　基因优化　酶学性质 中图分类号　Ｑ７５ ［１］ 　　１９７１年 Ｒｏｂｙｔ 首次报道了由斯氏假单胞菌 　　麦芽四糖淀粉酶从淀粉的非还原末端特异地顺序 （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ）中得到麦芽四糖淀粉酶（ｇｌｕｃａｎ 切割第４个 １，４糖苷键，产物为麦芽四糖。该糖属直 α １，４ａｌｐｈａｍａｌｔｏｔｅｔｒａｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ，Ｇ ，ＥＣ３．２．１．６０），进行 链麦芽低聚糖，是一种新型的“功能性食品”原料，具甜 ４， 了分离纯化及底物专一性的研究。１９８９年，Ｊｉａｎｈｕａ 度低、粘度较高、保湿性好、增稠作用强等良好的食品 ［２］ ［７］ Ｚｈｏｕ等 对 来 自嗜 糖 假 单 胞 菌 （ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 加工适应性 ，同时还具有有一定的耐酸、耐热、易形 ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）的麦芽四糖淀粉酶展开了基因序列和结 成光泽皮膜等特性，日本等国家已率先对麦芽四糖进 构功能域的研究，酶前体的编码区含有 １６５３个核苷 行研究，并取得了一些成果，少数产品已开始批量生 酸，前体蛋白氮端含有２１个氨基酸残基的信号肽，催 产，广泛用于医疗、保健等领域［８９］ 化区和底物结合区在嗜糖假单胞菌中高度保守。１９９２ 　　同时，麦芽四糖淀粉酶作为一种新型外切淀粉酶， ［３］ 在解决淀粉类食品老化和回生有重要作用。人们常通 年，严自正 等人从中国南方土壤中筛选、分离得到一 株产碱菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．）高产麦芽四糖淀粉酶，并进 过添加名目繁多的食品添加剂，来改善淀粉类食品因 ［４］ ［１０］ 行了发酵条件研究。１９９８年，ＫｏｂａｙａｓｈｉＨ 从深海沟 老化和回生而带来的差口感和短货架期的问题 ，但 中分离了一株产麦芽四糖淀粉酶的假单胞菌 ＭＳ３００， 添加剂的安全性问题却值得关注。麦芽四糖淀粉酶通 发现该菌产生两种麦芽四糖淀粉酶，并且在深水压力 过切短支链淀粉侧链，降低其形成双螺旋的趋向，以及 下比在大气压下产生更多的淀粉酶。同时，马建华［５］ 平衡直链淀粉的分解的复合作用，从而降低支链淀粉 ［６］