国境口岸轮状病毒(A组)、诺沃克病毒、星状病毒的多重RT-PCR检测方法.DOC

国境口岸轮状病毒(A组)、诺沃克病毒、星状病毒的多重RT-PCR检测方法 编制说明 （征求意见稿） 目 录 1 工作概述 2 1.1 任务来源 2 1.2 制定本标准的目的和意义 2 1.3 国内外有关标准的简要说明 3 2 标准的制定基础 3 3 标准方法研制过程 4 3.1 材料来源 4 3.2 方法建立 4 3.2.1 方法建立的技术路线和过程 4 3.2.2 引物设计和优化 5 3.2.3 多重RT-PCR反应条件的优化 5 3.2.4 灵敏度实验 6 3.2.5 大样本的评价实验 7 4 方法的验证 8 5 建议 8 6 参考文献和标准 8 7 附件 9 7.1 广东出入境检验检疫局验证报告 9 7.2 厦门国际旅行卫生保健中心验证报告 10 7.3 广州市妇女儿童医疗中心验证报告 11 1 工作概述 1.1 任务来源 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准由国家质量监督检验检疫总局批准。 计划编号：2011B175 类别：卫生检疫 标准名称：国境口岸轮状病毒(A组)、诺沃克病毒、星状病毒的多重RT-PCR检测方法 负责起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 本标准主要起草人：莫秋华、谭华、李卫岗、梁玉英、史咏梅、杨泽、涂承宁 1.2 制定标准的目的和意义RT-PCR快速检测方法，以满足口岸卫生检疫部门开展腹泻病监测和防控的需要，并能提高检测工作的效率，缩短检测时间。 腹泻病（Diarrhea Diseases）是一组多病原、多因素引起的疾病，目前它已成为严重影响人类健康的一个重要公共卫生问题。世界卫生组织（WHO）20世纪90年代的统计结果显示：全世界5岁以下婴幼儿，每年有10亿患腹泻，可导致500万小儿死亡。在第三世界国家，腹泻病是造成幼儿死亡的第一原因。在中国，腹泻病是仅次于呼吸道疾病的第二位多发病，也是婴幼儿死亡的两大病因之一。我国卫生部早已把腹泻病列为儿科重点防治的疾病之一。 腹泻病分为感染性腹泻和非感染性腹泻两大类，其临床表现轻重不等，多表现为腹痛、腹泻、呕吐、发热等症状，严重者还伴有脱水、电解质紊乱甚至休克、死亡。在感染性腹泻病中，目前已知引起腹泻的病原体有数十种之多，但国内报告以细菌性和病毒性腹泻占多数。虽然不同自然环境和生产、生活方式不同的地区，引起腹泻病的主要病原体有所不同，但总体上居首位的是志贺氏菌及轮状病毒。病毒性腹泻在感染性腹泻中占有重要的比例，轮状病毒(Rotavirus，RV)、诺沃克病毒（Norwalk virus, NVs）和星状病毒（Astrovirus，AVs）等3种胃肠炎病毒是主要的病原体。它们均是RNA病毒，通过水、食物等途径在儿童和成人中引起急性胃肠炎的散发和暴发，甚至大流行,如2008年初在英国出现的诺沃克病毒大暴发，每周约有10万人感染该病毒，严重影响人们健康和社会发展。 在国境口岸针对出入境可疑胃肠炎发病人员的查验工作中，在应对可能的突发公共卫生事件中，均迫切需求能快速检出致病病原体的检测方法。基于RT-PCR的分子生物学技术是病毒检测首选的方法。如果采用一次实验能同时检出以上3种常见腹泻病病毒的多病原体联检技术，即所谓多重（3重）RT-PCR技术，将能大大加快检测的速度，提高工作效率，节省试剂成本，对于防止急性胃肠炎的暴发、大流行，保障人民健康，做好公共卫生工作都具有重要意义。 1.3 国内外有关标准的简要说明 截止2012年7月，经检索，目前没有相关行业标准涉及多重RT-PCR检测方法通过一次实验同时检测轮状病毒、诺沃克病毒和星状病毒等3种病毒。 具体来说，目前已颁布或尚在制订中的检验检疫行业标准均只涉及到以上3种病毒中的某一种的检测，并且主要为食品专业的标准，卫生检疫专业的较少。列举如下： 目前涉及以上3种病毒的相关检验检疫行业标准，已颁布实施的有6项，其中4项是食品专业（分别是：SN/T 2520-2010贝类中A群轮状病毒检测方法 普通PCR和实时荧光PCR方法；SN/T 1635-2005 贝类中诺沃克病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR检测；SN/T 2730-2010进出口食品中诺如病毒检测 酶联免疫吸附法SN/T 2519-2010贝类中星状病毒检测方法 普通PCR和实时荧光PCR方法），另2项是卫生检疫专业（分别是：SN/T1720-2006 出入境口岸轮状病毒感染监测规程；SN/T2626-2010 国境口岸诺如病毒检测方法）； 仍在制修订当中的计划项目有1项（属于卫生检疫专业）：2009B229 口岸食源性疾病轮状病毒（A组）荧光PCR检测方法。 2 标准的制定基础 本标准制订单位是国家质检总局批准设立的“国家级腹泻病检测重点实验室”，长期在腹泻病领域开展检测和科学研究工作。实验室