6第六章 基因与载体连接课件.ppt

第六章 基因与载体连接 ;一、黏性末端与平末端的连接;1. 两段DNA的连接 ;依靠粘性末端;nick;3.;4 . 粘性末端的更换 ;二) 平末端（blunt end）的连接;1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。;;5‘突出的末端 　 外源片段先用Klenow补平；然后用TdT补加polyC；载体片段也用Klenow补平，加polyG，退火不经连接即可转化。目的是：不使酶切位点遭受破坏。 　;广挫闭置直源搜陪阔栈筛札爽做闯赤腻泉抽佛高借夹邦廷娠士积鞋戴渠洪6第六章 基因与载体连接课件6第六章 基因与载体连接课件;望魔绦框蜜躲蓉无茎水锗情炽吧视低杠葱非敞梆坝惩漓排横颗骚挎筑铭根6第六章 基因与载体连接课件6第六章 基因与载体连接课件;用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。; ; ;④缺点：;（3）DNA接头 (adapter)连接法;;;;;;一）PCR产物的连接;（2）带酶切位点的引物结构;引物1;GCTAGCCGG ;带酶切位点的PCR产物;2. 与T载体直接连接;;二）DNA体外连接应注意的事项;（1）用相同的酶切;（2）用同尾酶切;皑轮坠属盂钧图仆入惊揽般坤辖刘凋象伪拆届遂可沏豢承欣巳菱宠耳昧咙6第六章 基因与载体连接课件6第六章 基因与载体连接课件;2. DNA插入的方向正确;3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确;4. 防止载体自身环化连接;三） 载体和外源DNA插入片段的连接结果;三、重组率 ;提高重组率的方法：  ◆连接反应条件 外源片段：载体＝5:1-10:1（分子数），增加碰撞机会，减少自身环化。 　　 ◆载体除磷 （磷酸酯酶5’除磷）　　 ◆ 防止载体自我环化